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【摘要】目的分析广西壮族人群中白细胞介素27（IL27）单核苷酸多态性（SNP）位点rs4740和rs181206的各基因型及等位基因型的分布频率，并对不同种族间的分布差异进行分析。方法利用SNaPshot SNP分型技术检测150名广西壮族人IL27基因SNP位点rs4740和rs181206的基因型，与国际人类基因组单倍型图谱计划（HapMap）上的四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的SNP分型数据做对比，分析IL27基因SNP位点rs4740和rs181206的基因型及等位基因频率在以上五个人群之间的差异。结果在广西壮族人群中可发现白介素基因rs4740和rs181206存在多态性，广西壮族人群白介素基因rs4740位点的基因型和等位基因频率与非洲人群、日本人群的差异有统计学意义（P<0.05），而与欧洲人群、中国北京人群的差异无统计学意义（P>0.05）；广西壮族人群白介素基因rs181206位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群、非洲人群、日本人群以及中国北京人群的差异均有统计学意义（P<0.05）。结论广西壮族人群中白介素SNP位点rs4740和rs181206基因型及等位基因型的分布频率与其他地区人群相比存在差异，这种差异可能导致某些疾病在不同地区间的发病率和临床表现存在差异。
【关键词】白细胞介素27；单核苷酸多态性；基因型；种族
中图分类号：R394文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.03.001
【Abstract】ObjectiveTo analyze distribution frequency of genotype and allele of interleukin27 （IL27） single nucleotide polymorphism （SNP） locus rs4740 and rs181206 of Zhuang population in Guangxi，and to analyze distribution differences among different races.MethodsSNaPshot SNP typing technology was used to test IL27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes in 150 cases of Zhuang population in Guangxi，and comparing the abovementioned rs4740 and rs181206 genotypes to SNP typing data from four populations （Europe，Africa，Japan，and Beijing） on the international human genome haplotype map（HapMap）.And then，differences between IL27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele frequencies among the abovementioned five groups were analyzed.Results Polymorphism of interleukin gene rs4740 and rs181206 was found in Zhuang population in Guangxi.Difference of genotype and allele frequency of rs4740 locus in Zhuang population in Guangxi and those of African population and Japanese population was statistically significant（P<0.05），but difference of those of European population and Beijing population was not statistically significant（P>0.05）.However，differences of genotype and allele frequency of rs181206 locus in Zhuang population in Guangxi and those of European population，African population，Japanese population and Beijing population were all statistically significant（P<0.05）.ConclusionThere is difference between SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele distribution frequencies of Zhuang population in Guangxi and those of population in other areas，this difference may lead to differences in the incidence and clinical manifestations of certain diseases in different regions.
【Key words】IL27；single nucleotide polymorphism；genotype；race
白细胞介素27（interleukin27，IL27），新近发现的IL6/IL12家族的细胞因子，大部分由已活化的抗原提呈细胞（包括树突状以及单核巨噬细胞）产生，是由p28和EBI3两个亚基构成的异源二聚体，通过与其受体IL27R（WSX1/gp130）结合发挥生物学功能[1]。IL27具有亲和与抗炎的特性，可以通过调节辅助T细胞的发展，抑制T细胞增殖，刺激细胞毒性T细胞的活性，诱导B细胞同种型的转换，并且还参与多种自身免疫病[2]。近年来随着流行病学的发展，研究发现IL27的多个位点与多种肿瘤密切相关[3，4]，它具有抗肿瘤活性和抗血管生成活性。因而，准确分析不同地区及人群中的白介素基因多态性分布，可以为基因多态性与某些疾病的发生收集更多数据并提供研究价值。我们采用SNaPshot SNP分型技术对150名广西壮族人群白介素基因rs4740位点和rs181206位点的遗传多态性进行分析，将数据结果与国际人类基因组单倍型图谱计划（HapMap）公布的四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的SNP检测结果对比，从而分析不同人种白介素基因的SNP是否存在差异，以期为与白介素相关的遗传和疾病等方面的研究提供实验依据资料。 1资料与方法1.1一般资料从右江民族医学院附属医院选择150名进行健康体检并且体检结果健康者作为研究对象（2012年1～8月）。研究对象要在广西长期居住（时间>10年），籍贯均为广西，民族均为壮族。在150名研究对象中，男性87名，女性63名，年龄范围25～84岁，各项临床及实验室检查指标均正常。
1.2基因组DNA的提取每位受试者抽取静脉血2 ml，使用碘化钠法提取细胞基因组DNA，低温保存待用。
1.3PCR技术通过在NCBI上查找到的白介素基因DNA序列，选择包含rs4740位点和rs181206位点的序列并输入到Primer 5引物设计软件，从而得到用于特异性扩增包含rs4740与rs181206位点白介素基因的PCR上下游引物和延伸引物。其中，rs4740位点的上游引物序列为：5’CAGTGGCCCCTCTCCATCTTCT3’， 下游引物序列为：5’CGAGGACCCAGGTGCTGTCTG3’，延伸引物序列为：5’TTTTTTTTTTCGGCCCCGAGCCAGGTACTAC3’。rs181206位点的上游引物序列为：5’CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG3’，下游引物序列为：5’GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC3’，延伸引物序列为：5’TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC3’。20 μL白介素基因的PCR扩增反应体系包括：10×PCR反应缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，HotStar Taq DNA聚合酶1.0 U，基因组DNA1.0 μL，不足体积20 μL用水补足。PCR产物4℃保存。PCR反应条件为：94℃，15 min；94℃×30 s，60℃×30 s，72℃×20 s，共35个循环；72℃×10 min。最后PCR产物4℃保存。
1.4SNaPshot SNP分型技术用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit对经过虾碱酶和外切酶Ⅰ纯化后的PCR产物进行延伸反应，然后在ABI 3130XL对用虾碱酶纯化后的延伸产物进行上样，最后用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）来分析SNP分型。
1.5统计学方法根据测序结果直接对白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率进行计算，并从NCBI查找到HapMap公布的白介素基因rs4740以及rs181206位点在四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的分型结果，采用SPSS 17.0软件进行χ2检验，对比广西壮族人群与四个人群的基因型和等位基因频率的差异，检验水准：α=0.05。
2结果2.1白介素基因位点rs4740和rs181206的检测结果包含白介素基因rs4740位点和rs181206位点的PCR扩增产物片段大小分别为250 bp和248 bp。从ABI 3130XL的SNP分型结果中可得，rs4740位点的基因型有三种，分别为AA、GG和AG，基因分型结果见图1。rs181206位点的基因型有三种，分别为AA、GG和AG（该位点没有基因型为G/G的样本），基因分型结果见图2。
2.2广西壮族人群白介素基因多态性分布根据检测结果对白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率进行计算，经χ2检验，150份样本的白介素基因位点rs4740和rs181206的基因型及等位基因频率符合HardyWeinberg平衡，说明研究对象可以代表中国广西地区人群白介素基因多态性分布情况，rs4740位点和rs181206位点的统计结果分别如表1和表2所示，在广西壮族人群中，白介素基因A等位基因型在以上两个位点的频率均为最高，其中在rs4740位点约为51.0%，在rs181206位点约为53.0%；GA基因型在以上两个位点最常见，其中在rs4740位点约为474%，在rs181206位点约为94.0%，并且可知白介素基因型及等位基因频率男女组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3广西壮族人群与其他四个人群白介素基因多态性的比较广西壮族人群白介素基因多态性与其他四个人群的比较结果显示，广西壮族人群白介素基因rs4740位点的基因型和等位基因频率与非洲、日本人群的差异有统计学意义（P<0.05），而与欧洲、中国北京人群的差异无统计学意义（P>005）。广西壮族人群白介素基因rs181206位点的基因型和等位基因频率与欧洲、非洲、日本人群以及中国北京人群的差异均有统计学意义（P<0001）。比较结果如表3和表4所示。
3讨论
IL27由p28和EBI3亚基通过二硫键结合形成，其基因位于第16对染色体短臂上（16p11），具有4个内含子和5个外显子[5]。早期发现p28单独不能分泌，后研究发现两亚基不完全同时表达，只有两亚基同时表达才能高效分泌IL27[6]。IL27 是 Th1 类细胞因子，由可溶性受体 EBI3和螺旋状蛋白IL27 p28两个亚基组成，通过广泛表达于各种免疫细胞表面的IL27受体 WSX1 gp130发挥生物学效应[7]。
多数相关研究证实，IL27基因单核苷酸多态性位点与多种疾病具有相关性。喻紫晨[8]采用PCR以及酶联免疫吸附试验检测160例骨肉瘤患者（研究组）和250例健康者（对照组）中IL27基因964A/G，2905T/C和4730T/C，得出血清IL27p28低水平可能与骨肉瘤进展有关，但IL27基因964A/G，2905T/C和4730T/C多态性及它们的单倍型与骨肉瘤的风险无关联。黄艳平等[3]采用酶联免疫吸附试验法检测41例初治MM患者（观察组）和40例健康体检者（对照组）血浆IL27的表达，得出在初治MM中，IL27表达下降，未发现总体生存时间有预测效能。冯佳等人[1]运用Meta分析方法综合评价中国人群IL27 p28基因多态性与肿瘤的关系，检索中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库等收集IL27 p28基因多态性与肿瘤相关的文献。依据纳入和排除标准筛选合适文献并提取所需数据，使用软件（Stata12.0 Stata Corp， College Station，TX，USA）对数据进行系统分析，中国人群IL27 p28基因多态性 rs17855750位点G等位基因型和GG+GT基因型可能与肿瘤遗传易感性有关。
本研究利用SNaPshot SNP分型技术检测150名广西壮族人群白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型，并通过HapMap上四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的SNP分型数据，对比五个人群的白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率差异。通过对比结果显示白介素基因型频率男女组间比较差异无显著性，说明此位点基因型分布与性别没有关系；从对比广西壮族人群位点rs4740与rs181206同欧洲、非洲、日本以及中国北京人群可知：广西壮族人群白介素基因rs4740位点的基因型和等位基因频率与非洲、日本人群的差异显著，而与欧洲、中国北京人群的差异不明显。广西壮族人群白介素基因rs181206位点的基因型和等位基因频率与欧洲、非洲、日本人群以及中国北京人群的差异均有显著性。因此说明白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率与人种有着密切关系。
研究结果不仅提供了白介素基因位点rs4740和rs181206在广西壮族人群的多态性分布，并对比了白介素基因在不同人种的SNP差异，为与白介素相关的疾病研究提供了参考研究资料，也为人类学和群体遗传学补充了重要数据。
参考文献
[1]冯佳，夏燕，向诗非，等.IL27基因多态性与肿瘤易感性关联的Meta分析[J].免疫学杂志，2015，31（11）：969972.
[2]祁荆荆，王莹，石冰玉，等.IL27通过调节淋巴细胞亚群参与干燥综合征[J].免疫学杂志，2015，31（12）：10561066.
[3]黄艳平，黄锦雄，杨飞燕，等.探讨suPAR与IL-27对多发性骨髓瘤总体生存时间的预测效能[J].重庆医学，2016，45（6）：760762.
[4]刘智豪，朱小彤，李明松，等.IL27 在肿瘤免疫治疗中的潜在价值[J].免疫学杂志，2016，32（1）：8992.
[5]Wang OC，Huang GL，Yang F，et al.IL27 rs153109 polymorphism increases the risk of colorectal cancer in Chinese Han population[J].Onco Targets Ther，2015（8）：14931497.
[6]王利娟，王满侠.IL27对辅助T细胞相关疾病的作用[J].中国免疫学杂志，2016，32（2）：284288.
[7]邱熔芳，李际盛，高贵敏，等.IL27p28 基因启动子区域964A>G位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性[J].山东大学学报：医学版，2008，46（11）：10221027.
[8]喻紫晨.IL27基因多态性和血清IL27p28水平与骨肉瘤风险相关性分析[J].实用癌症杂志，2016，31（2）：183186.
（编辑：潘明志）
【关键词】白细胞介素27；单核苷酸多态性；基因型；种族
中图分类号：R394文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.03.001
【Abstract】ObjectiveTo analyze distribution frequency of genotype and allele of interleukin27 （IL27） single nucleotide polymorphism （SNP） locus rs4740 and rs181206 of Zhuang population in Guangxi，and to analyze distribution differences among different races.MethodsSNaPshot SNP typing technology was used to test IL27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes in 150 cases of Zhuang population in Guangxi，and comparing the abovementioned rs4740 and rs181206 genotypes to SNP typing data from four populations （Europe，Africa，Japan，and Beijing） on the international human genome haplotype map（HapMap）.And then，differences between IL27 gene SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele frequencies among the abovementioned five groups were analyzed.Results Polymorphism of interleukin gene rs4740 and rs181206 was found in Zhuang population in Guangxi.Difference of genotype and allele frequency of rs4740 locus in Zhuang population in Guangxi and those of African population and Japanese population was statistically significant（P<0.05），but difference of those of European population and Beijing population was not statistically significant（P>0.05）.However，differences of genotype and allele frequency of rs181206 locus in Zhuang population in Guangxi and those of European population，African population，Japanese population and Beijing population were all statistically significant（P<0.05）.ConclusionThere is difference between SNP locus rs4740 and rs181206 genotypes and allele distribution frequencies of Zhuang population in Guangxi and those of population in other areas，this difference may lead to differences in the incidence and clinical manifestations of certain diseases in different regions.
【Key words】IL27；single nucleotide polymorphism；genotype；race
白细胞介素27（interleukin27，IL27），新近发现的IL6/IL12家族的细胞因子，大部分由已活化的抗原提呈细胞（包括树突状以及单核巨噬细胞）产生，是由p28和EBI3两个亚基构成的异源二聚体，通过与其受体IL27R（WSX1/gp130）结合发挥生物学功能[1]。IL27具有亲和与抗炎的特性，可以通过调节辅助T细胞的发展，抑制T细胞增殖，刺激细胞毒性T细胞的活性，诱导B细胞同种型的转换，并且还参与多种自身免疫病[2]。近年来随着流行病学的发展，研究发现IL27的多个位点与多种肿瘤密切相关[3，4]，它具有抗肿瘤活性和抗血管生成活性。因而，准确分析不同地区及人群中的白介素基因多态性分布，可以为基因多态性与某些疾病的发生收集更多数据并提供研究价值。我们采用SNaPshot SNP分型技术对150名广西壮族人群白介素基因rs4740位点和rs181206位点的遗传多态性进行分析，将数据结果与国际人类基因组单倍型图谱计划（HapMap）公布的四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的SNP检测结果对比，从而分析不同人种白介素基因的SNP是否存在差异，以期为与白介素相关的遗传和疾病等方面的研究提供实验依据资料。 1资料与方法1.1一般资料从右江民族医学院附属医院选择150名进行健康体检并且体检结果健康者作为研究对象（2012年1～8月）。研究对象要在广西长期居住（时间>10年），籍贯均为广西，民族均为壮族。在150名研究对象中，男性87名，女性63名，年龄范围25～84岁，各项临床及实验室检查指标均正常。
1.2基因组DNA的提取每位受试者抽取静脉血2 ml，使用碘化钠法提取细胞基因组DNA，低温保存待用。
1.3PCR技术通过在NCBI上查找到的白介素基因DNA序列，选择包含rs4740位点和rs181206位点的序列并输入到Primer 5引物设计软件，从而得到用于特异性扩增包含rs4740与rs181206位点白介素基因的PCR上下游引物和延伸引物。其中，rs4740位点的上游引物序列为：5’CAGTGGCCCCTCTCCATCTTCT3’， 下游引物序列为：5’CGAGGACCCAGGTGCTGTCTG3’，延伸引物序列为：5’TTTTTTTTTTCGGCCCCGAGCCAGGTACTAC3’。rs181206位点的上游引物序列为：5’CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG3’，下游引物序列为：5’GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC3’，延伸引物序列为：5’TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC3’。20 μL白介素基因的PCR扩增反应体系包括：10×PCR反应缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，HotStar Taq DNA聚合酶1.0 U，基因组DNA1.0 μL，不足体积20 μL用水补足。PCR产物4℃保存。PCR反应条件为：94℃，15 min；94℃×30 s，60℃×30 s，72℃×20 s，共35个循环；72℃×10 min。最后PCR产物4℃保存。
1.4SNaPshot SNP分型技术用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit对经过虾碱酶和外切酶Ⅰ纯化后的PCR产物进行延伸反应，然后在ABI 3130XL对用虾碱酶纯化后的延伸产物进行上样，最后用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）来分析SNP分型。
1.5统计学方法根据测序结果直接对白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率进行计算，并从NCBI查找到HapMap公布的白介素基因rs4740以及rs181206位点在四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的分型结果，采用SPSS 17.0软件进行χ2检验，对比广西壮族人群与四个人群的基因型和等位基因频率的差异，检验水准：α=0.05。
2结果2.1白介素基因位点rs4740和rs181206的检测结果包含白介素基因rs4740位点和rs181206位点的PCR扩增产物片段大小分别为250 bp和248 bp。从ABI 3130XL的SNP分型结果中可得，rs4740位点的基因型有三种，分别为AA、GG和AG，基因分型结果见图1。rs181206位点的基因型有三种，分别为AA、GG和AG（该位点没有基因型为G/G的样本），基因分型结果见图2。
2.2广西壮族人群白介素基因多态性分布根据检测结果对白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率进行计算，经χ2检验，150份样本的白介素基因位点rs4740和rs181206的基因型及等位基因频率符合HardyWeinberg平衡，说明研究对象可以代表中国广西地区人群白介素基因多态性分布情况，rs4740位点和rs181206位点的统计结果分别如表1和表2所示，在广西壮族人群中，白介素基因A等位基因型在以上两个位点的频率均为最高，其中在rs4740位点约为51.0%，在rs181206位点约为53.0%；GA基因型在以上两个位点最常见，其中在rs4740位点约为474%，在rs181206位点约为94.0%，并且可知白介素基因型及等位基因频率男女组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3广西壮族人群与其他四个人群白介素基因多态性的比较广西壮族人群白介素基因多态性与其他四个人群的比较结果显示，广西壮族人群白介素基因rs4740位点的基因型和等位基因频率与非洲、日本人群的差异有统计学意义（P<0.05），而与欧洲、中国北京人群的差异无统计学意义（P>005）。广西壮族人群白介素基因rs181206位点的基因型和等位基因频率与欧洲、非洲、日本人群以及中国北京人群的差异均有统计学意义（P<0001）。比较结果如表3和表4所示。
3讨论
IL27由p28和EBI3亚基通过二硫键结合形成，其基因位于第16对染色体短臂上（16p11），具有4个内含子和5个外显子[5]。早期发现p28单独不能分泌，后研究发现两亚基不完全同时表达，只有两亚基同时表达才能高效分泌IL27[6]。IL27 是 Th1 类细胞因子，由可溶性受体 EBI3和螺旋状蛋白IL27 p28两个亚基组成，通过广泛表达于各种免疫细胞表面的IL27受体 WSX1 gp130发挥生物学效应[7]。
多数相关研究证实，IL27基因单核苷酸多态性位点与多种疾病具有相关性。喻紫晨[8]采用PCR以及酶联免疫吸附试验检测160例骨肉瘤患者（研究组）和250例健康者（对照组）中IL27基因964A/G，2905T/C和4730T/C，得出血清IL27p28低水平可能与骨肉瘤进展有关，但IL27基因964A/G，2905T/C和4730T/C多态性及它们的单倍型与骨肉瘤的风险无关联。黄艳平等[3]采用酶联免疫吸附试验法检测41例初治MM患者（观察组）和40例健康体检者（对照组）血浆IL27的表达，得出在初治MM中，IL27表达下降，未发现总体生存时间有预测效能。冯佳等人[1]运用Meta分析方法综合评价中国人群IL27 p28基因多态性与肿瘤的关系，检索中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库等收集IL27 p28基因多态性与肿瘤相关的文献。依据纳入和排除标准筛选合适文献并提取所需数据，使用软件（Stata12.0 Stata Corp， College Station，TX，USA）对数据进行系统分析，中国人群IL27 p28基因多态性 rs17855750位点G等位基因型和GG+GT基因型可能与肿瘤遗传易感性有关。
本研究利用SNaPshot SNP分型技术检测150名广西壮族人群白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型，并通过HapMap上四个人群（欧洲、非洲、日本和中国北京人群）的SNP分型数据，对比五个人群的白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率差异。通过对比结果显示白介素基因型频率男女组间比较差异无显著性，说明此位点基因型分布与性别没有关系；从对比广西壮族人群位点rs4740与rs181206同欧洲、非洲、日本以及中国北京人群可知：广西壮族人群白介素基因rs4740位点的基因型和等位基因频率与非洲、日本人群的差异显著，而与欧洲、中国北京人群的差异不明显。广西壮族人群白介素基因rs181206位点的基因型和等位基因频率与欧洲、非洲、日本人群以及中国北京人群的差异均有显著性。因此说明白介素基因rs4740位点和rs181206位点的基因型及等位基因频率与人种有着密切关系。
研究结果不仅提供了白介素基因位点rs4740和rs181206在广西壮族人群的多态性分布，并对比了白介素基因在不同人种的SNP差异，为与白介素相关的疾病研究提供了参考研究资料，也为人类学和群体遗传学补充了重要数据。
参考文献
[1]冯佳，夏燕，向诗非，等.IL27基因多态性与肿瘤易感性关联的Meta分析[J].免疫学杂志，2015，31（11）：969972.
[2]祁荆荆，王莹，石冰玉，等.IL27通过调节淋巴细胞亚群参与干燥综合征[J].免疫学杂志，2015，31（12）：10561066.
[3]黄艳平，黄锦雄，杨飞燕，等.探讨suPAR与IL-27对多发性骨髓瘤总体生存时间的预测效能[J].重庆医学，2016，45（6）：760762.
[4]刘智豪，朱小彤，李明松，等.IL27 在肿瘤免疫治疗中的潜在价值[J].免疫学杂志，2016，32（1）：8992.
[5]Wang OC，Huang GL，Yang F，et al.IL27 rs153109 polymorphism increases the risk of colorectal cancer in Chinese Han population[J].Onco Targets Ther，2015（8）：14931497.
[6]王利娟，王满侠.IL27对辅助T细胞相关疾病的作用[J].中国免疫学杂志，2016，32（2）：284288.
[7]邱熔芳，李际盛，高贵敏，等.IL27p28 基因启动子区域964A>G位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性[J].山东大学学报：医学版，2008，46（11）：10221027.
[8]喻紫晨.IL27基因多态性和血清IL27p28水平与骨肉瘤风险相关性分析[J].实用癌症杂志，2016，31（2）：183186.
（编辑：潘明志）