【摘 要】
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目的构建竞争性定量PCR检测幽门螺杆菌(Hp)cagA基因的内参标模板并做序列测定.方法根据cagA基因及Lac Ⅰ蛋白的特异性结合部位的序列,设计二对PCR引物(cagAp1,cagAp2,cagAp3,
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目的构建竞争性定量PCR检测幽门螺杆菌(Hp)cagA基因的内参标模板并做序列测定.方法根据cagA基因及Lac Ⅰ蛋白的特异性结合部位的序列,设计二对PCR引物(cagAp1,cagAp2,cagAp3,cagAp4)其中cagAp1及cagAp3用于扩增cagA基因2593～2788位碱基间196 bp的片段,cagAp2及cagAp4用于扩增2789～2993位碱基之间204 bp的核酸片段;在cagAp1的5-端引入了BamHⅠ的限制性酶切位点,在cagAp2的5-端结合了Sal Ⅰ的限制性酶切点.在cagAp3的5-端引入Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列(21bp),在cagAp4的5-端结合了cagAp3之5-端21个碱基的反义DNA序列利用重组PCR,将乳糖操纵子中Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列重组入cagA基因400bp的片段中,得到cagA基因片段的重组体(rfcagA).将重组rfcagA定向克隆入pUC19进行序列测定.结果用DNA序列分析仪双向测定rfcagA的序列,其含400bp的cagA片段及Lac Ⅰ蛋白特异性结合部位的序列(21 bp),一级结构完全正确.结论内参标模板rfcagA构建,对竞争性定量PCR检测HpcagA基因的方法的建立具有重要价值.
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