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摘 要：建立高效液相色谱-串联质谱测定鸡肉中磺胺硝苯残留的方法。样品经过甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）提取，正己烷脱脂，液-液分配净化后，C18柱分离，甲醇、5 mmol/L乙酸铵为流动相梯度洗脱，采用负离子扫描多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下液质联用仪进行定性和定量分析。在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内，线性相关系数大于0.99，方法的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在2.0、5.0、10.0 μg/kg添加量的回收率为76.0%～83.4%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于8.7%。该方法简便快捷，可用于鸡肉中磺胺硝苯残留量测定。
关键词：液相色谱-串联质谱；负离子模式；鸡肉；磺胺硝苯
Abstract： A method for the determination of sulfanitran in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were extracted with formic acid-ethyl acetate （2：98， V/V）， and the extract was defatted by hexane extraction and cleaned up by liquid-liquid partitioning. The analyte was separated on a C18 colum using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate solution with gradient elution. The mass spectrometry was operated in negative ion mode using multiple reaction monitoring （MRM） for qualitative and quantitative analysis. The calibration curve of the method was linear in the range of 2.0–100.0 μg/L， with correlation coefficient more than 0.99. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 μg/kg and 2.0 μg/kg， respectively. At spiked levels of 2.0， 5.0， 10.0 μg/kg， the recoveries ranged from 76.0% to 83.4% with relative standard deviations （RSD） less than 8.7%. This method proved to be convenient and suitable for the determination of sulfanitran residues in chicken.
Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry； negative ion mode； chicken； sulfanitran
DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.08.007
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）08-0035-04
磺胺硝苯属于磺胺类的一种抗球虫药物，此药抑制球虫体内的二氢叶酸合成酶阻碍叶酸合成导致核酸合成受阻从而使虫体繁殖受到抑制，该药作用是在球虫无性繁殖阶段抑制第二代裂殖体的发育，对第一代裂殖体也有一定抑制作用，主要用于家禽球虫病的治疗与预防[1]。研究表明，磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，人体长期食用含有此类药物的食品会在体中蓄积，进而对人体机能产生危害[2-4]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血[5]，并导致病原体产生抗药性，发生过敏反应[6-7]。为保障食用者的安全我国及欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为：单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg[8-14]。
目前使用现代分析仪器对动物源性食品、化妆品及饲料中磺胺硝苯检测的方法文献报道很多，主要有液相色谱法[15-18]和液相色谱-串联质谱法[19-25]。液相色谱-串联质谱抗干扰能力强、选择性好检测灵敏度高，已被广泛应用于磺胺类兽药残留检测。文献所报道的液相色谱-串联质谱法检测磺胺硝苯的方法均是正离子监测模式，尚未有使用负离子监测模式的方法报道。本实验分别优化了正、负离子监测模式下的仪器方法。通过实验验证，使用负离子监测模式的灵敏度高于正离子监测模式，降低了磺胺硝苯的检测限，更好地保障消费者的安全。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉样品购于淮安苏果超市。
磺胺硝苯（纯度为98%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯 美国默克公司；正己烷、甲酸均为色谱纯 美国天地公司；无水硫酸钠为分析纯 南京化学试剂有限公司；水为超纯水。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括自动进样器Autosampler 1.3）、MS Pump 2.0质谱泵 美国Thermo Fisher公司；ZORBAX SB-C18色谱柱 美国Agilent公司；氮吹仪 美国Organomation 公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪 宁波新芝生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
准确称取磺胺硝苯标准品10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存，实验中根据需要用甲醇稀释至适当质量浓度的标准工作液。
1.3.2 样品提取
准确称取（5.00±0.05） g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V），于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；以8 000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用8 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）重复提取残渣1 次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，10 000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。
1.3.3 HPLC-MS/MS条件
HPLC条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～4 min 70%A；4.1～6.5 min 20% A；6.6～8.5 min 70% A；流速：250 μL/min。
MS/MS条件：采用ESI源；负离子方式扫描；喷雾电压：2 500 V；离子源温度：400 ℃；鞘气：40 bar，辅助气：15 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或者叔氨基的化学电离性质，文献[26-28]报道的都是选用ESI+作为离子化模式。本实验在已有文献[29-30]报道的基础上，采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1 μg/mL的标准物质，以5 μL/min的流速注入离子源中。首先在正离子模式下进行一级质谱分析，得到m/z 336.0分子离子峰，通过对辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化获得m/z 336.0，最高响应值为3.69×105，仪器响应强度较低；对磺胺硝苯在负离子模式下进行一级质谱扫描分析，得到m/z 334.0分子离子峰，通过优化辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数获得m/z 334.0最高响应为1.3×106，是正离子模式响应强度的3.5 倍，选定负离子模式进行监测，再对m/z 334.0准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息。然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳，得到m/z 136.5、270碎片离子。实验结果发现，相同进样量的磺胺硝苯用Q1扫描ESI（-）比ESI（+）具有更高的响应值（图1），灵敏度大幅度提高，所以磺胺硝苯采用负离子模式监测。
2.2 流动相的选择
磺胺硝苯采用ESI（-）离子模式监测，在流动相中未添加甲酸或者乙酸等酸性供质子体物质。本实验考察了甲醇-水、乙腈-水混合溶剂作为流动相对磺胺硝苯的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，甲醇-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积高于乙腈-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积。实验还比较了在水相加入5 mmol/L乙酸铵对色谱峰的影响，研究表明，流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵时，峰形优于甲醇-水为流动相，因此选择甲醇-5 mmol/L乙酸铵为流动相。
2.3 提取溶剂的选择
磺胺硝苯具有较强极性，pKa为14.5，易溶于酸性溶液和乙腈、乙酸乙酯、甲醇等极性有机溶剂。本实验考察了乙腈、甲酸-乙酸乙酯（1∶199、1∶99、2∶98、3：97、4∶96、5∶95，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明，上述几种溶剂对磺胺硝苯均有较好的提取效果，乙腈对肌肉组织渗透能力较强，沉淀蛋白的效果较好，提取的脂肪含量较少，但是提取的基质干扰较大，磺胺硝苯受基质效应影响较强，添加回收率较低；乙酸乙酯提取的基质干扰较少，但提取出较多的脂肪，可以通过正己烷脱脂净化处理去掉脂肪，添加回收率明显优于乙腈；磺胺硝苯易溶于酸性溶液，使用酸性乙酸乙酯提取回收率高于乙酸乙酯，实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸体积分数加大，磺胺硝苯的回收率逐渐提高，当其体积分数大于2%时回收率增加不明显，加大甲酸用量可以加强沉淀蛋白的效果，但是随着甲酸体积分数的提高，提取的基质干扰较多，因此，采用甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）混合溶液作为提取溶剂。
2.4 基质效应、准曲线线性范围及定量限
2.5 方法的回收率和精密度
选取阴性鸡肉样品，添加磺胺硝苯标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个水平进行5 次平行实验，按上述优化的实验方法测定各组分的回收率和相对标准偏差，结果见表2。
3 结 论
本实验建立了负离子监测模式测定鸡肉中磺胺硝苯残留的高效液相色谱-串联质法，较正离子监测模式仪器灵敏度大幅度提高，采用基质标准曲线来减弱基质效应对磺胺硝苯定量分析的影响。该方法操作简便快速，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要。
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关键词：液相色谱-串联质谱；负离子模式；鸡肉；磺胺硝苯
Abstract： A method for the determination of sulfanitran in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were extracted with formic acid-ethyl acetate （2：98， V/V）， and the extract was defatted by hexane extraction and cleaned up by liquid-liquid partitioning. The analyte was separated on a C18 colum using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate solution with gradient elution. The mass spectrometry was operated in negative ion mode using multiple reaction monitoring （MRM） for qualitative and quantitative analysis. The calibration curve of the method was linear in the range of 2.0–100.0 μg/L， with correlation coefficient more than 0.99. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 μg/kg and 2.0 μg/kg， respectively. At spiked levels of 2.0， 5.0， 10.0 μg/kg， the recoveries ranged from 76.0% to 83.4% with relative standard deviations （RSD） less than 8.7%. This method proved to be convenient and suitable for the determination of sulfanitran residues in chicken.
Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry； negative ion mode； chicken； sulfanitran
DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.08.007
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）08-0035-04
磺胺硝苯属于磺胺类的一种抗球虫药物，此药抑制球虫体内的二氢叶酸合成酶阻碍叶酸合成导致核酸合成受阻从而使虫体繁殖受到抑制，该药作用是在球虫无性繁殖阶段抑制第二代裂殖体的发育，对第一代裂殖体也有一定抑制作用，主要用于家禽球虫病的治疗与预防[1]。研究表明，磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，人体长期食用含有此类药物的食品会在体中蓄积，进而对人体机能产生危害[2-4]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血[5]，并导致病原体产生抗药性，发生过敏反应[6-7]。为保障食用者的安全我国及欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为：单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg[8-14]。
目前使用现代分析仪器对动物源性食品、化妆品及饲料中磺胺硝苯检测的方法文献报道很多，主要有液相色谱法[15-18]和液相色谱-串联质谱法[19-25]。液相色谱-串联质谱抗干扰能力强、选择性好检测灵敏度高，已被广泛应用于磺胺类兽药残留检测。文献所报道的液相色谱-串联质谱法检测磺胺硝苯的方法均是正离子监测模式，尚未有使用负离子监测模式的方法报道。本实验分别优化了正、负离子监测模式下的仪器方法。通过实验验证，使用负离子监测模式的灵敏度高于正离子监测模式，降低了磺胺硝苯的检测限，更好地保障消费者的安全。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉样品购于淮安苏果超市。
磺胺硝苯（纯度为98%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯 美国默克公司；正己烷、甲酸均为色谱纯 美国天地公司；无水硫酸钠为分析纯 南京化学试剂有限公司；水为超纯水。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括自动进样器Autosampler 1.3）、MS Pump 2.0质谱泵 美国Thermo Fisher公司；ZORBAX SB-C18色谱柱 美国Agilent公司；氮吹仪 美国Organomation 公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪 宁波新芝生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
准确称取磺胺硝苯标准品10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存，实验中根据需要用甲醇稀释至适当质量浓度的标准工作液。
1.3.2 样品提取
准确称取（5.00±0.05） g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V），于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；以8 000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用8 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）重复提取残渣1 次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，10 000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。
1.3.3 HPLC-MS/MS条件
HPLC条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～4 min 70%A；4.1～6.5 min 20% A；6.6～8.5 min 70% A；流速：250 μL/min。
MS/MS条件：采用ESI源；负离子方式扫描；喷雾电压：2 500 V；离子源温度：400 ℃；鞘气：40 bar，辅助气：15 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或者叔氨基的化学电离性质，文献[26-28]报道的都是选用ESI+作为离子化模式。本实验在已有文献[29-30]报道的基础上，采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1 μg/mL的标准物质，以5 μL/min的流速注入离子源中。首先在正离子模式下进行一级质谱分析，得到m/z 336.0分子离子峰，通过对辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化获得m/z 336.0，最高响应值为3.69×105，仪器响应强度较低；对磺胺硝苯在负离子模式下进行一级质谱扫描分析，得到m/z 334.0分子离子峰，通过优化辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数获得m/z 334.0最高响应为1.3×106，是正离子模式响应强度的3.5 倍，选定负离子模式进行监测，再对m/z 334.0准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息。然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳，得到m/z 136.5、270碎片离子。实验结果发现，相同进样量的磺胺硝苯用Q1扫描ESI（-）比ESI（+）具有更高的响应值（图1），灵敏度大幅度提高，所以磺胺硝苯采用负离子模式监测。
2.2 流动相的选择
磺胺硝苯采用ESI（-）离子模式监测，在流动相中未添加甲酸或者乙酸等酸性供质子体物质。本实验考察了甲醇-水、乙腈-水混合溶剂作为流动相对磺胺硝苯的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，甲醇-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积高于乙腈-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积。实验还比较了在水相加入5 mmol/L乙酸铵对色谱峰的影响，研究表明，流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵时，峰形优于甲醇-水为流动相，因此选择甲醇-5 mmol/L乙酸铵为流动相。
2.3 提取溶剂的选择
磺胺硝苯具有较强极性，pKa为14.5，易溶于酸性溶液和乙腈、乙酸乙酯、甲醇等极性有机溶剂。本实验考察了乙腈、甲酸-乙酸乙酯（1∶199、1∶99、2∶98、3：97、4∶96、5∶95，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明，上述几种溶剂对磺胺硝苯均有较好的提取效果，乙腈对肌肉组织渗透能力较强，沉淀蛋白的效果较好，提取的脂肪含量较少，但是提取的基质干扰较大，磺胺硝苯受基质效应影响较强，添加回收率较低；乙酸乙酯提取的基质干扰较少，但提取出较多的脂肪，可以通过正己烷脱脂净化处理去掉脂肪，添加回收率明显优于乙腈；磺胺硝苯易溶于酸性溶液，使用酸性乙酸乙酯提取回收率高于乙酸乙酯，实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸体积分数加大，磺胺硝苯的回收率逐渐提高，当其体积分数大于2%时回收率增加不明显，加大甲酸用量可以加强沉淀蛋白的效果，但是随着甲酸体积分数的提高，提取的基质干扰较多，因此，采用甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）混合溶液作为提取溶剂。
2.4 基质效应、准曲线线性范围及定量限
2.5 方法的回收率和精密度
选取阴性鸡肉样品，添加磺胺硝苯标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个水平进行5 次平行实验，按上述优化的实验方法测定各组分的回收率和相对标准偏差，结果见表2。
3 结 论
本实验建立了负离子监测模式测定鸡肉中磺胺硝苯残留的高效液相色谱-串联质法，较正离子监测模式仪器灵敏度大幅度提高，采用基质标准曲线来减弱基质效应对磺胺硝苯定量分析的影响。该方法操作简便快速，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要。
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