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摘 要：建立超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定鸡肉中勃地龙的不确定度评价方法，以提高检测结果的准确性。在建立不确定度评定的数学模型基础上，寻找检测过程中各不确定度分量，用统计分析的方法对各分量进行评定，合成标准不确定度，根据概率分布计算扩展不确定度。结果表明：校准曲线拟合和标准溶液配制对不确定度的贡献最大;当鸡肉中勃地龙残留量为7.425 μg/kg时，其扩展不确定度为0.754 μg/kg（k=2）。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱;鸡肉;勃地龙;不确定度
Uncertainty Evaluation for the Determination of Boldenone Residues in Chicken by Ultra-High Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin*
（Hebei Food Inspection and Research Institute， Hebei Food Safety Key Laboratory， Shijiazhuang 050227， China）
Abstract： In order to improve the accuracy of the detection of boldenone in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， a method for uncertainty evaluation was established. Based on the established mathematical model for uncertainty evaluation， the uncertainty components arising from the analytical process were determined and evaluated by statistical analysis. The standard uncertainty was synthesized， and the extended uncertainty was calculated according to the probability distribution. It was found that calibration curve fitting and standard solution preparation made the greatest contribution to the uncertainty. When the boldenone residue in chicken was 7.425 μg/kg，
the expanded uncertainty was 0.754 μg/kg （k = 2）.
Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; boldenone; uncertainty
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）10-0048-06
引文格式：
赵盼， 马俊美， 郭丽敏. 超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中勃地龙残留量的不确定度评定[J]. 肉类研究， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125. http：//www.rlyj.net.cn
ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin. Uncertainty evaluation for the determination of boldenone residues in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125. http：//www.rlyj.net.cn
兴奋剂是国际奥委会对运动员禁用药物的统称，使用兴奋剂会对人体身心造成严重的危害。目前国际奥委会将兴奋剂分为7 大类，其中合成类固醇又称蛋白同化激素、通化激素等，是目前使用最广的一类兴奋剂。它们能促进畜禽生长，有利于蛋白质沉积，在畜牧业养殖中使用较为广泛。但食用含有合成类固醇激素残留的动物食品会危害人类身体健康，因此，世界各国对合成类固醇激素采取禁用或限用，我国在动物食品抽检中多次检出类固醇激素残留，影响我国该类食品的出口。勃地龙又叫勃地酮、宝丹酮或去氢睾酮，分子式为C19H26O2，是合成類固醇激素的一种。世界反兴奋剂机构发布《2018年禁用清单国际标准》，该清单明确规定勃地龙为禁用物质。因此，准确检测动物源性食品中勃地龙残留量具有重要意义[1-3]。 在检测分析中，由于受检测仪器、检测方法及实验误差的影响，检测值往往偏离真实值。如何判定检测结果真实有效，不确定度是一个重要的参考指标。对检测过程中可能存在的不确定度进行评价可提高检测结果的准确度，避免因检测标准的完善性及实验人员操作的准确性不足对检测结果造成影响，从而得到更加真实客观的检测结果[4-5]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定鸡肉中勃地龙的不确定度，通过分析实验中的不确定度来源，对各因素进行评定和合成，最后计算出测量值的扩展不确定度[6-7]，为鸡肉中勃地龙检验检测结果评定提供一定的指导，同时为测量其他激素残留量的不确定度评定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉基质购自石家庄市农贸市场。
勃地龙（纯度≥98%）、睾丸酮-D3（100 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Triple Quad 6500 UPLC-MS/MS（配有电喷雾离子源）、Analyst?（Version 1.6）、MultiQuant（Version 2.1）软件 美国Sciex公司;PL203/ME204E电子天平
梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;CR22N高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;P300H超声波清
洗器 德国Elma公司;Vortex Genius 3旋涡混合器 德国
IKA公司;有机尼龙微孔滤膜（0.22 μm） 天津艾杰尔公司;ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
准确称取1.0 mg勃地龙标准品于10.0 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成质量浓度100 μg/mL标准储备液，用移液枪准确吸取1 mL标准储备液到10 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成10 μg/mL中间标准溶液。准确吸取100 μg/mL睾丸酮-D3标准溶液500 μL到5.0 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成质量浓度为10 μg/mL内标储备液。
用移液枪分别吸取10、20、50、100、200、1 000 μL中间标准溶液到100.0 mL容量瓶内，再分别加入100 μL内标储备液，用乙腈-水（1∶1，V/V）定容，配制成1、2、5、10、20、100 ng/mL标准工作溶液，内标工作液质量浓度均为10.00 ng/mL，上机测试。
1.3.2 样品前处理
提取：称取（5.00±0.05）g试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 μg/mL内标工作液2 μL，加入碳酸钠溶液3 mL和叔丁基甲醚25 mL，均质30 s，振荡10 min，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，将上清液转移至梨形瓶中，将离心残渣用25 mL叔丁基甲醚重复再提取1次，合并上清液。
净化：将上清液转移至50 mL梨形瓶，于40 ℃水浴中旋转蒸发至干。用2.0 mL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）溶解残余物，漩涡混匀后，溶液冷冻30 min，16 000 r/min离心5 min，取适量溶液经0.22 μm滤膜过滤至样品瓶中，供上机测定。
1.3.3 检测条件
色谱條件：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相A：体积分数0.1%甲酸-水溶液;流动相B：乙腈;梯度洗脱;流速0.25 mL/min;进样量1.0 μL;柱温30 ℃。洗脱程序：0～1.00 min、20% B，1.00～3.00 min、20%～90% B，3.0～4.5 min、90% B，4.51～6.00 min、20% B。
质谱条件：电喷雾离子源正离子模式，毛细管电压5 500 V，多反应监测模式，离子源温度550 ℃，气帘气压力25 psi，辅助加热气压力（GS1）50 psi，辅助加热气压力（GS2）50 psi。
1.3.4 数学模型建立
按照农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11 种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》，样品中勃地龙残留量按下式计算。
式中：X为样品中勃地龙残留量/（μg/kg）;ρ为通过峰面积根据标准工作曲线中计算出的上机样液中检测物质量浓度/（ng/mL）;V为上机样液最终定容体积/mL;m为试样质量/g;n为样品制备过程中的稀释因子。
2 结果与分析
2.1 不确定度来源分析
根据检测过程和数学模型分析，对影响勃地龙检测结果的各不确定度分量来源进行评估，不确定度的来源主要有标准溶液配制、校准曲线拟合、样品称量、样品提取、净化过程、样品定容、样品重复性检测、仪器设备等[8-9]，详见图1。
图 1 UPLC-MS-MS 检测勃地龙过程中的不确定度来源
Fig. 1 Uncertainty sources in the determination of boldenone by UPLC-MS-MS
2.2 不确定度评定
2.2.1 标准溶液配制产生的相对不确定度urel（C）
标准溶液配制产生的不确定度有：标准物质纯度产生的不确定度u（C1）、标准物质称量产生的不确定度u（C2）、标准溶液移取产生的不确定度u（C3）和标准溶液定容产生的不确定度u（C4）[8]。
2.2.1.1 标准物质纯度产生的不确定度u（C1） 勃地龙标准品纯度为98.8%，扩展不确定度为1%，包含因子k=2（证书给出），取正态分布[10-12]，由勃地龙标准品纯度产生的标准不确定度为，相对标准不确定度。
睾丸酮-D3标准溶液质量浓度为100 μg/mL，扩展不确定度为3%，包含因子k=2（证书给出），取正态分布，由睾丸酮-D3标准溶液质量浓度产生的标准不确定度为 μg/mL，相对标准不确定度。
综上，由标准物质纯度产生的相对标准不确定度。
2.2.1.2 标准物质称量产生的不确定度u（C2）
用十万分之一电子天平称取1.00 mg勃地龙标准品，该天平检定证书给出示值误差的检定结果为-0.02 mg，取均匀分布[13-15]，其标准不确定度，其相对标准不确定度。
2.2.1.3 标准溶液移取产生的不确定度u（C3）
使用移液器吸取储备液和中间液，检定证书给出相应的容量相对误差[16]，取均匀分布[17-19]，标准溶液移取产生的相对标准不确定度。（V1、V2均为移取液体体积）标准溶液移取过程中产生的不确定度见表1。
标准溶液移取产生的相对标准不确定度为。
2.2.1.4 标准溶液定容产生的不确定度u（C4）
标准溶液定容产生的不确定度有容量瓶容量允差产生的不确定度u（C容量瓶）和甲醇、乙腈-水（1∶1，V/V）定容液体积膨胀产生的不确定度u（C体积膨胀）[20-22]。
容量瓶（A级）经计量检定合格，容量允差按照JJG 196—2006《玻璃仪器检定规程》[23]执行，服从三角分配[8，24]，温度差忽略不计，由容量瓶容量允差产生的相对标准不确定度（表2），其相对标准不确定度。
本实验在21.8 ℃环境下操作，勃地龙储备液和中间液分别用甲醇定容至10 mL、内标储备液用甲醇定容至5 mL，工作液均用乙腈-水（1∶1，V/V）定容至100 mL，甲醇体积膨胀系数为β甲醇=1.1×10-3，乙腈体积膨胀系数β乙腈=1.37×10-3，水体积膨胀系数β水=2.1×10-3，服从均匀分布，温度差ΔT为1.8 ℃，根据公式，计算得甲醇体积膨胀产生的相对标准不确定度为urel（C甲醇体积膨胀）≈0.001 14，乙腈-水体积膨胀产生的相对标准不确定度为urel（C乙腈-水体积膨胀）≈0.001 80。定容液体积膨胀产生的不确定度为
标准溶液定容产生的相对标准不确定度
因此，标准溶液配制产生的不确定度。
2.2.2 样品称量产生的不确定度urel（m）
样品称量使用百分之一电子天平，该检定证书给出示值误差的检定结果为0.01 g，取均匀分布，称样量为（5.00±0.05）g，其相对标准不确定度。
2.2.3 样品定容产生的不确定度urel（V）
样品定容体积为2 mL，使用1 000 μL移液枪移取2 次，1 000 μL移液枪移取1 000 μL溶液容量相对误差为0.4%，服从均匀分布，计算方法同2.2.1.3节，样品定容产生的相对标准不确定度。
2.2.4 校准曲线拟合产生的不确定度urel（A0）
用乙腈-水溶液（1∶1，V/V）将勃地龙中间液分别配制成质量浓度为1、2、5、10、20、100 μg/L标准工作溶液，同时分别加入0.1 mL 10 μg/mL内标工作液，按指定方法条件进行测试，以待测物溶液质量浓度与内标溶液质量浓度的比值为横坐标，以待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线[10，18，25]，线性范围为1～100 ng/mL，采用最小二乘法拟合得到线性回归方程
Y=bX+a，斜率b=0.191 81，截距a=0.034 69，相关系数r=0.999 26。
对阴性鸡肉样品加标后分别测定6 次，根据标准曲线计算所得样品检测结果见表3。
由标准曲线拟合产生的不确定度，其中。
式中：SR表示标准溶液峰面积的标准残差;n表示對标准溶液的测定次数（n=6），f表示对样品的测定次数（f=6）;0表示检测样品溶液质量浓度除以内标溶液质量浓度的平均值;表示标准工作溶液各质量浓度除以内标溶液质量浓度的平均值;c0表示检测样品质量浓度与内标溶液质量浓度的比值;Yi表示标准工作溶液中各质量浓度点检测的实际峰面积与内标峰面积的比值，ci表示标准溶液质量浓度与内标溶液质量浓度的比值。
经计算得SR≈0.022 1，u（A0）≈0.081 5，则校准曲线拟合产生的相对标准不确定度。
2.2.5 样品重复性检测产生的不确定度urel（x）
称取阴性鸡肉样品6 份，每份质量（5.00±0.05）g，分别添加400 μL 100 ng/mL标准溶液，即加标水平为8 μg/kg，检测结果见表4。重复性检测引入的测量不确定度属于A类不确定度[26-27]，将平均测定值代入贝塞尔公式计算标准偏差≈0.114（其中，n表示测定次数，n=6），则样品重复性检测产生的不确定度（n=6），其相对标准不确定度。
2.2.6 样品提取、净化过程产生的不确定度urel（R）
目标化合物不能从基质中完全提取，在提取、净化过程中损失造成的不确定度，用加标回收率方法进行计算[28-29]，加标回收率结果见表4。将平均回收率代入贝塞尔公式计算得6 次检测结果的标准偏差S（R）≈0.014 2，则样品提取、净化过程产生的不确定度，。
计算t值对回收率进行显著性检验，，将t值与95%置信度、（n-1）自由度下的双侧临界值t0.05/5进行比较，查检验表t0.05/5=2.571，t>t0.05/5，表明回收率与100%具有显著性差异，需采用回收率校正因子对检测结果进行修正。 2.2.7 UPLC-MS/MS产生的不确定度urel（fQ）
该设备校准证书给出其不确定度u=0.6%，k=2，则。
2.2.8 扩展不确定度和结果表示
根据上述各相对不确定度分量数值计算相对合成标准不确定度urel（y）和合成标准不确定度u，取95%置信度，包含因子k=2，计算扩展不确定度U。
3 结 论
通过分析鸡肉中勃地龙残留量的不确定度，得出当检测结果为7.425 μg/kg时，在95%置信区间内，其扩展不确定度为0.754 μg/kg。各不确定度分量中，影响较大的有校准曲线拟合、标准溶液配制，其影响大小依次为urel（A0）>urel（C）>urel（x）/urel（R）>urel（V）>urel（fQ）>urel（m），在标准溶液配制中，以标准物质纯度和移液器移取引入的不确定度最大。因此，建议在检测时增加标准曲线的检测次数，保证标准溶液配制准确可靠，尽量选择不确定度小的标准物质、容量误差小的移液器、误差小的电子天平等设备，提高检测人员的技术水平和仪器设备的准确性，以减小测量不确定度，确保检测结果准确可靠。
参考文献：
[1] VAN DE KERKHOF D H， DE BOER D， THIJSSEN J H H， et al. Evaluation of testosterone/epitestosterone ratio influential factors as determined in doping analysis[J]. Journal of Analytical Toxicology， 2000， 24（2）： 102-115. DOI：10.1093/jat/24.2.102.
[2] GOMEZ C， POZO O J， GEYER H， et al. New potential markers for the detection of boldenone misuse[J]. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology， 2012， 132（3/5）： 239-246. DOI：10.1016/j.jsbmb.2012.05.010.
[3] CHIESA L， NOBILE M， PANSERI S， et al. Detection of boldenone， its conjugates and androstadienedione， as well as five corticosteroids in bovine bile through a unique immunoaffinity column clean-up and two validated liquid chromatography-tandem mass spectrometry analyses[J]. Analytica Chimica Acta， 2014， 852： 137-145. DOI：10.1016/j.aca.2014.09.002.
[4] DHAKAL P， ADHIKARI M， THAPA B S， et al. Uncertainty evaluation of efficiency measurement in laboratory conditions[J]. Journal of Physics： Conference Series， 2020， 1608： 012007. DOI：10.1088/1742-6596/1608/1/012007.
[5] ZHUSSUPBEKOV S S， KHAN S G， IBRAYEVA L K. The analysis of approaches to measurement uncertainty evaluation for calibration[J]. Informatyka Automatyka Pomiary w Gospodarce i Ochronie ?rodowiska， 2019， 9（3）： 26-29. DOI：10.35784/IAPGOS.233.
[6] 国家质量监督检验检疫总局. 测量不确定度评定和表示： GB/T 27418-2017[S]. 北京： 中国标准出版社， 2018.
[7] 国家质量监督检验检疫总局. 测量不确定度评定与表示： JJF 1059.1-2012[S]. 北京： 中国质检出版社， 2013.
[8] 施元旭， 张水锋， 潘项捷， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定菜籽油中乙基麦芽酚残留量的不确定度评定[J]. 中国油脂， 2021， 46（1）： 141-145. DOI：10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.01.028.
[9] 吴迪， 刘笑笑， 王莹， 等. 分光光度法测定酸菜中亚硝酸盐含量的不确定度评定[J]. 东北农业科学， 2020， 45（5）： 107-111. DOI：10.16423/j.cnki.1003-8701.2020.05.026.
[10] 刘柱， 徐潇颖， 趙超群， 等. 同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的不确定度评定[J]. 食品工业科技， 2020， 41（5）： 206-214. DOI：10.13386 /j.issn1002-0306.2020.05.034.
[11] 刘顺字， 韩文节， 欧志鹏， 等. 液相色谱法测定蔬菜中3 种氨基甲酸酯类农药残留量的不确定性评价[J]. 江苏农业学报， 2020， 36（6）： 1569-1574. DOI：10.3969 /j.issn.1000-4440.2020.06.029. [12] 黄坤， 郭嘉. 高效液相色谱-荧光法测定谷物及其制品中苯并（a）芘的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（24）： 185-190. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2019.24.029.
[13] 李静， 张居舟， 余晓娟， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中植物生长调节剂残留量的不确定度评定[J]. 食品科学， 2019， 40（10）： 292-297. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20180323-304.
[14] 孟繁磊， 李刚， 蔡玉红， 等. UPLC-MS-MS法测定花生中黄曲霉毒素的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2018， 39（7）： 154-159. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.07.027.
[15] YUAN J， XIA C G， LIU X Y， et al. Uncertainty evaluation for the determination of components in bauxite samples by X-ray fluorescence spectrometry[J]. Advances in Analytical Chemistry， 2016， 6（2）： 29-34. DOI：10.12677/AAC.2016.62005.
[16] 國家质量监督检验检疫总局. 移液器： JJG 646—2006[S]. 北京： 中国计量出版社， 2007.
[17] 王春艳， 聂绪恒， 袁毅， 等. 玉米中黄曲霉毒素B1测定的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（16）： 89-94. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2019.16.017.
[18] 涂凡， 李佳文， 阮胜军. 高效液相色谱-串联质谱法测定鲜活小龙虾中孔雀石绿不确定度评定[J]. 化学分析计量， 2020， 29（6）： 136-140. DOI：10.3969/j.issn.1008-6145.2020.06.031.
[19] 黄坤， 刘迪， 张菊， 等. 同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中3 种喹诺酮类兽药残留的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2021， 12（1）： 101-107.
[20] 聂磊， 汪永信， 殷俊峰. HPLC测定花椒粉中罗丹明B含量的不确定度评定[J]. 安徽农业科学， 2020， 48（16）： 195-197; 226.
[21] 潘秀丽， 张虹艳， 王小乔， 等. Oasis MCX柱-高效液相色谱/三重四极杆质谱联用法测定火锅底料中罂粟壳不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（23）： 8912-8919.
[22] 温海滨， 熊含鸿， 梁旭霞， 等. 超高效液相色谱-三重四级杆质谱法测定猪肉中氯霉素残留量的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（16）： 5448-5454.
[23] 国家质量监督检验检疫总局. 常用玻璃量器： JJG 196—2006[S]. 北京： 中国计量出版社， 2007.
[24] 段路路， 黄婧， 王凯越. HPLC法测定水溶性肥料植物生长调节剂的不确定度评定[J]. 中国农业科技导报， 2020， 22（9）： 169-178.
[25] 李文杰， 陈涛， 倪建秀， 等. 超高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定水产品中氟苯尼考及其代谢物残留量的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（21）： 7927-7934. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.21.044.
[26] CHEN W Z. Evaluation of measurement uncertainty of impact resistance of ceramic brick[C]//2020 International Conference on Energy， Environment and Bioengineering， Sanya， China， January 10-12， 2020.
[27] 徐列兵， 郭强， 贾煜， 等. 气相色谱-质谱法测定食用植物油中短链脂肪酸的测量不确定度评定[J]. 化学分析计量，2021， 30（1）： 87-91. DOI：10.3969/j.issn.1008-6145.2021.01.018.
[28] 潘城， 胡朝阳， 吴凌， 等. 高效液相色谱法测定蔬菜中异菌脲残留量的不确定度分析[J]. 食品科学， 2017， 38（24）： 235-240. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201724038.
[29] 陆春胜， 马莉， 陈云忠. 能力验证样品中玉米赤霉烯酮含量测定的不确定度评定[J]. 分析仪器， 2020（6）： 100-105. DOI：10.3969/j.issn.1001-232x.2020.06.019.
收稿日期：2021-05-11
基金项目：河北省市场监督管理局科技计划项目（2020ZD08）
第一作者简介：赵盼（1983—）（ORCID： 0000-0001-6883-3058），女，工程师，学士，研究方向为食品质量安全。
E-mail： [email protected]
*通信作者简介：郭丽敏（1970—）（ORCID： 0000-0003-2191-9916），女，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品质量安全。E-mail： [email protected]
关键词：超高效液相色谱-串联质谱;鸡肉;勃地龙;不确定度
Uncertainty Evaluation for the Determination of Boldenone Residues in Chicken by Ultra-High Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin*
（Hebei Food Inspection and Research Institute， Hebei Food Safety Key Laboratory， Shijiazhuang 050227， China）
Abstract： In order to improve the accuracy of the detection of boldenone in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， a method for uncertainty evaluation was established. Based on the established mathematical model for uncertainty evaluation， the uncertainty components arising from the analytical process were determined and evaluated by statistical analysis. The standard uncertainty was synthesized， and the extended uncertainty was calculated according to the probability distribution. It was found that calibration curve fitting and standard solution preparation made the greatest contribution to the uncertainty. When the boldenone residue in chicken was 7.425 μg/kg，
the expanded uncertainty was 0.754 μg/kg （k = 2）.
Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; boldenone; uncertainty
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）10-0048-06
引文格式：
赵盼， 马俊美， 郭丽敏. 超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中勃地龙残留量的不确定度评定[J]. 肉类研究， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125. http：//www.rlyj.net.cn
ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin. Uncertainty evaluation for the determination of boldenone residues in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125. http：//www.rlyj.net.cn
兴奋剂是国际奥委会对运动员禁用药物的统称，使用兴奋剂会对人体身心造成严重的危害。目前国际奥委会将兴奋剂分为7 大类，其中合成类固醇又称蛋白同化激素、通化激素等，是目前使用最广的一类兴奋剂。它们能促进畜禽生长，有利于蛋白质沉积，在畜牧业养殖中使用较为广泛。但食用含有合成类固醇激素残留的动物食品会危害人类身体健康，因此，世界各国对合成类固醇激素采取禁用或限用，我国在动物食品抽检中多次检出类固醇激素残留，影响我国该类食品的出口。勃地龙又叫勃地酮、宝丹酮或去氢睾酮，分子式为C19H26O2，是合成類固醇激素的一种。世界反兴奋剂机构发布《2018年禁用清单国际标准》，该清单明确规定勃地龙为禁用物质。因此，准确检测动物源性食品中勃地龙残留量具有重要意义[1-3]。 在检测分析中，由于受检测仪器、检测方法及实验误差的影响，检测值往往偏离真实值。如何判定检测结果真实有效，不确定度是一个重要的参考指标。对检测过程中可能存在的不确定度进行评价可提高检测结果的准确度，避免因检测标准的完善性及实验人员操作的准确性不足对检测结果造成影响，从而得到更加真实客观的检测结果[4-5]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定鸡肉中勃地龙的不确定度，通过分析实验中的不确定度来源，对各因素进行评定和合成，最后计算出测量值的扩展不确定度[6-7]，为鸡肉中勃地龙检验检测结果评定提供一定的指导，同时为测量其他激素残留量的不确定度评定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉基质购自石家庄市农贸市场。
勃地龙（纯度≥98%）、睾丸酮-D3（100 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Triple Quad 6500 UPLC-MS/MS（配有电喷雾离子源）、Analyst?（Version 1.6）、MultiQuant（Version 2.1）软件 美国Sciex公司;PL203/ME204E电子天平
梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;CR22N高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;P300H超声波清
洗器 德国Elma公司;Vortex Genius 3旋涡混合器 德国
IKA公司;有机尼龙微孔滤膜（0.22 μm） 天津艾杰尔公司;ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
准确称取1.0 mg勃地龙标准品于10.0 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成质量浓度100 μg/mL标准储备液，用移液枪准确吸取1 mL标准储备液到10 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成10 μg/mL中间标准溶液。准确吸取100 μg/mL睾丸酮-D3标准溶液500 μL到5.0 mL容量瓶内，用甲醇定容，配制成质量浓度为10 μg/mL内标储备液。
用移液枪分别吸取10、20、50、100、200、1 000 μL中间标准溶液到100.0 mL容量瓶内，再分别加入100 μL内标储备液，用乙腈-水（1∶1，V/V）定容，配制成1、2、5、10、20、100 ng/mL标准工作溶液，内标工作液质量浓度均为10.00 ng/mL，上机测试。
1.3.2 样品前处理
提取：称取（5.00±0.05）g试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 μg/mL内标工作液2 μL，加入碳酸钠溶液3 mL和叔丁基甲醚25 mL，均质30 s，振荡10 min，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，将上清液转移至梨形瓶中，将离心残渣用25 mL叔丁基甲醚重复再提取1次，合并上清液。
净化：将上清液转移至50 mL梨形瓶，于40 ℃水浴中旋转蒸发至干。用2.0 mL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）溶解残余物，漩涡混匀后，溶液冷冻30 min，16 000 r/min离心5 min，取适量溶液经0.22 μm滤膜过滤至样品瓶中，供上机测定。
1.3.3 检测条件
色谱條件：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流动相A：体积分数0.1%甲酸-水溶液;流动相B：乙腈;梯度洗脱;流速0.25 mL/min;进样量1.0 μL;柱温30 ℃。洗脱程序：0～1.00 min、20% B，1.00～3.00 min、20%～90% B，3.0～4.5 min、90% B，4.51～6.00 min、20% B。
质谱条件：电喷雾离子源正离子模式，毛细管电压5 500 V，多反应监测模式，离子源温度550 ℃，气帘气压力25 psi，辅助加热气压力（GS1）50 psi，辅助加热气压力（GS2）50 psi。
1.3.4 数学模型建立
按照农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11 种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》，样品中勃地龙残留量按下式计算。
式中：X为样品中勃地龙残留量/（μg/kg）;ρ为通过峰面积根据标准工作曲线中计算出的上机样液中检测物质量浓度/（ng/mL）;V为上机样液最终定容体积/mL;m为试样质量/g;n为样品制备过程中的稀释因子。
2 结果与分析
2.1 不确定度来源分析
根据检测过程和数学模型分析，对影响勃地龙检测结果的各不确定度分量来源进行评估，不确定度的来源主要有标准溶液配制、校准曲线拟合、样品称量、样品提取、净化过程、样品定容、样品重复性检测、仪器设备等[8-9]，详见图1。
图 1 UPLC-MS-MS 检测勃地龙过程中的不确定度来源
Fig. 1 Uncertainty sources in the determination of boldenone by UPLC-MS-MS
2.2 不确定度评定
2.2.1 标准溶液配制产生的相对不确定度urel（C）
标准溶液配制产生的不确定度有：标准物质纯度产生的不确定度u（C1）、标准物质称量产生的不确定度u（C2）、标准溶液移取产生的不确定度u（C3）和标准溶液定容产生的不确定度u（C4）[8]。
2.2.1.1 标准物质纯度产生的不确定度u（C1） 勃地龙标准品纯度为98.8%，扩展不确定度为1%，包含因子k=2（证书给出），取正态分布[10-12]，由勃地龙标准品纯度产生的标准不确定度为，相对标准不确定度。
睾丸酮-D3标准溶液质量浓度为100 μg/mL，扩展不确定度为3%，包含因子k=2（证书给出），取正态分布，由睾丸酮-D3标准溶液质量浓度产生的标准不确定度为 μg/mL，相对标准不确定度。
综上，由标准物质纯度产生的相对标准不确定度。
2.2.1.2 标准物质称量产生的不确定度u（C2）
用十万分之一电子天平称取1.00 mg勃地龙标准品，该天平检定证书给出示值误差的检定结果为-0.02 mg，取均匀分布[13-15]，其标准不确定度，其相对标准不确定度。
2.2.1.3 标准溶液移取产生的不确定度u（C3）
使用移液器吸取储备液和中间液，检定证书给出相应的容量相对误差[16]，取均匀分布[17-19]，标准溶液移取产生的相对标准不确定度。（V1、V2均为移取液体体积）标准溶液移取过程中产生的不确定度见表1。
标准溶液移取产生的相对标准不确定度为。
2.2.1.4 标准溶液定容产生的不确定度u（C4）
标准溶液定容产生的不确定度有容量瓶容量允差产生的不确定度u（C容量瓶）和甲醇、乙腈-水（1∶1，V/V）定容液体积膨胀产生的不确定度u（C体积膨胀）[20-22]。
容量瓶（A级）经计量检定合格，容量允差按照JJG 196—2006《玻璃仪器检定规程》[23]执行，服从三角分配[8，24]，温度差忽略不计，由容量瓶容量允差产生的相对标准不确定度（表2），其相对标准不确定度。
本实验在21.8 ℃环境下操作，勃地龙储备液和中间液分别用甲醇定容至10 mL、内标储备液用甲醇定容至5 mL，工作液均用乙腈-水（1∶1，V/V）定容至100 mL，甲醇体积膨胀系数为β甲醇=1.1×10-3，乙腈体积膨胀系数β乙腈=1.37×10-3，水体积膨胀系数β水=2.1×10-3，服从均匀分布，温度差ΔT为1.8 ℃，根据公式，计算得甲醇体积膨胀产生的相对标准不确定度为urel（C甲醇体积膨胀）≈0.001 14，乙腈-水体积膨胀产生的相对标准不确定度为urel（C乙腈-水体积膨胀）≈0.001 80。定容液体积膨胀产生的不确定度为
标准溶液定容产生的相对标准不确定度
因此，标准溶液配制产生的不确定度。
2.2.2 样品称量产生的不确定度urel（m）
样品称量使用百分之一电子天平，该检定证书给出示值误差的检定结果为0.01 g，取均匀分布，称样量为（5.00±0.05）g，其相对标准不确定度。
2.2.3 样品定容产生的不确定度urel（V）
样品定容体积为2 mL，使用1 000 μL移液枪移取2 次，1 000 μL移液枪移取1 000 μL溶液容量相对误差为0.4%，服从均匀分布，计算方法同2.2.1.3节，样品定容产生的相对标准不确定度。
2.2.4 校准曲线拟合产生的不确定度urel（A0）
用乙腈-水溶液（1∶1，V/V）将勃地龙中间液分别配制成质量浓度为1、2、5、10、20、100 μg/L标准工作溶液，同时分别加入0.1 mL 10 μg/mL内标工作液，按指定方法条件进行测试，以待测物溶液质量浓度与内标溶液质量浓度的比值为横坐标，以待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线[10，18，25]，线性范围为1～100 ng/mL，采用最小二乘法拟合得到线性回归方程
Y=bX+a，斜率b=0.191 81，截距a=0.034 69，相关系数r=0.999 26。
对阴性鸡肉样品加标后分别测定6 次，根据标准曲线计算所得样品检测结果见表3。
由标准曲线拟合产生的不确定度，其中。
式中：SR表示标准溶液峰面积的标准残差;n表示對标准溶液的测定次数（n=6），f表示对样品的测定次数（f=6）;0表示检测样品溶液质量浓度除以内标溶液质量浓度的平均值;表示标准工作溶液各质量浓度除以内标溶液质量浓度的平均值;c0表示检测样品质量浓度与内标溶液质量浓度的比值;Yi表示标准工作溶液中各质量浓度点检测的实际峰面积与内标峰面积的比值，ci表示标准溶液质量浓度与内标溶液质量浓度的比值。
经计算得SR≈0.022 1，u（A0）≈0.081 5，则校准曲线拟合产生的相对标准不确定度。
2.2.5 样品重复性检测产生的不确定度urel（x）
称取阴性鸡肉样品6 份，每份质量（5.00±0.05）g，分别添加400 μL 100 ng/mL标准溶液，即加标水平为8 μg/kg，检测结果见表4。重复性检测引入的测量不确定度属于A类不确定度[26-27]，将平均测定值代入贝塞尔公式计算标准偏差≈0.114（其中，n表示测定次数，n=6），则样品重复性检测产生的不确定度（n=6），其相对标准不确定度。
2.2.6 样品提取、净化过程产生的不确定度urel（R）
目标化合物不能从基质中完全提取，在提取、净化过程中损失造成的不确定度，用加标回收率方法进行计算[28-29]，加标回收率结果见表4。将平均回收率代入贝塞尔公式计算得6 次检测结果的标准偏差S（R）≈0.014 2，则样品提取、净化过程产生的不确定度，。
计算t值对回收率进行显著性检验，，将t值与95%置信度、（n-1）自由度下的双侧临界值t0.05/5进行比较，查检验表t0.05/5=2.571，t>t0.05/5，表明回收率与100%具有显著性差异，需采用回收率校正因子对检测结果进行修正。 2.2.7 UPLC-MS/MS产生的不确定度urel（fQ）
该设备校准证书给出其不确定度u=0.6%，k=2，则。
2.2.8 扩展不确定度和结果表示
根据上述各相对不确定度分量数值计算相对合成标准不确定度urel（y）和合成标准不确定度u，取95%置信度，包含因子k=2，计算扩展不确定度U。
3 结 论
通过分析鸡肉中勃地龙残留量的不确定度，得出当检测结果为7.425 μg/kg时，在95%置信区间内，其扩展不确定度为0.754 μg/kg。各不确定度分量中，影响较大的有校准曲线拟合、标准溶液配制，其影响大小依次为urel（A0）>urel（C）>urel（x）/urel（R）>urel（V）>urel（fQ）>urel（m），在标准溶液配制中，以标准物质纯度和移液器移取引入的不确定度最大。因此，建议在检测时增加标准曲线的检测次数，保证标准溶液配制准确可靠，尽量选择不确定度小的标准物质、容量误差小的移液器、误差小的电子天平等设备，提高检测人员的技术水平和仪器设备的准确性，以减小测量不确定度，确保检测结果准确可靠。
参考文献：
[1] VAN DE KERKHOF D H， DE BOER D， THIJSSEN J H H， et al. Evaluation of testosterone/epitestosterone ratio influential factors as determined in doping analysis[J]. Journal of Analytical Toxicology， 2000， 24（2）： 102-115. DOI：10.1093/jat/24.2.102.
[2] GOMEZ C， POZO O J， GEYER H， et al. New potential markers for the detection of boldenone misuse[J]. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology， 2012， 132（3/5）： 239-246. DOI：10.1016/j.jsbmb.2012.05.010.
[3] CHIESA L， NOBILE M， PANSERI S， et al. Detection of boldenone， its conjugates and androstadienedione， as well as five corticosteroids in bovine bile through a unique immunoaffinity column clean-up and two validated liquid chromatography-tandem mass spectrometry analyses[J]. Analytica Chimica Acta， 2014， 852： 137-145. DOI：10.1016/j.aca.2014.09.002.
[4] DHAKAL P， ADHIKARI M， THAPA B S， et al. Uncertainty evaluation of efficiency measurement in laboratory conditions[J]. Journal of Physics： Conference Series， 2020， 1608： 012007. DOI：10.1088/1742-6596/1608/1/012007.
[5] ZHUSSUPBEKOV S S， KHAN S G， IBRAYEVA L K. The analysis of approaches to measurement uncertainty evaluation for calibration[J]. Informatyka Automatyka Pomiary w Gospodarce i Ochronie ?rodowiska， 2019， 9（3）： 26-29. DOI：10.35784/IAPGOS.233.
[6] 国家质量监督检验检疫总局. 测量不确定度评定和表示： GB/T 27418-2017[S]. 北京： 中国标准出版社， 2018.
[7] 国家质量监督检验检疫总局. 测量不确定度评定与表示： JJF 1059.1-2012[S]. 北京： 中国质检出版社， 2013.
[8] 施元旭， 张水锋， 潘项捷， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定菜籽油中乙基麦芽酚残留量的不确定度评定[J]. 中国油脂， 2021， 46（1）： 141-145. DOI：10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.01.028.
[9] 吴迪， 刘笑笑， 王莹， 等. 分光光度法测定酸菜中亚硝酸盐含量的不确定度评定[J]. 东北农业科学， 2020， 45（5）： 107-111. DOI：10.16423/j.cnki.1003-8701.2020.05.026.
[10] 刘柱， 徐潇颖， 趙超群， 等. 同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的不确定度评定[J]. 食品工业科技， 2020， 41（5）： 206-214. DOI：10.13386 /j.issn1002-0306.2020.05.034.
[11] 刘顺字， 韩文节， 欧志鹏， 等. 液相色谱法测定蔬菜中3 种氨基甲酸酯类农药残留量的不确定性评价[J]. 江苏农业学报， 2020， 36（6）： 1569-1574. DOI：10.3969 /j.issn.1000-4440.2020.06.029. [12] 黄坤， 郭嘉. 高效液相色谱-荧光法测定谷物及其制品中苯并（a）芘的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（24）： 185-190. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2019.24.029.
[13] 李静， 张居舟， 余晓娟， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中植物生长调节剂残留量的不确定度评定[J]. 食品科学， 2019， 40（10）： 292-297. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20180323-304.
[14] 孟繁磊， 李刚， 蔡玉红， 等. UPLC-MS-MS法测定花生中黄曲霉毒素的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2018， 39（7）： 154-159. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.07.027.
[15] YUAN J， XIA C G， LIU X Y， et al. Uncertainty evaluation for the determination of components in bauxite samples by X-ray fluorescence spectrometry[J]. Advances in Analytical Chemistry， 2016， 6（2）： 29-34. DOI：10.12677/AAC.2016.62005.
[16] 國家质量监督检验检疫总局. 移液器： JJG 646—2006[S]. 北京： 中国计量出版社， 2007.
[17] 王春艳， 聂绪恒， 袁毅， 等. 玉米中黄曲霉毒素B1测定的不确定度评定[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（16）： 89-94. DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2019.16.017.
[18] 涂凡， 李佳文， 阮胜军. 高效液相色谱-串联质谱法测定鲜活小龙虾中孔雀石绿不确定度评定[J]. 化学分析计量， 2020， 29（6）： 136-140. DOI：10.3969/j.issn.1008-6145.2020.06.031.
[19] 黄坤， 刘迪， 张菊， 等. 同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中3 种喹诺酮类兽药残留的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2021， 12（1）： 101-107.
[20] 聂磊， 汪永信， 殷俊峰. HPLC测定花椒粉中罗丹明B含量的不确定度评定[J]. 安徽农业科学， 2020， 48（16）： 195-197; 226.
[21] 潘秀丽， 张虹艳， 王小乔， 等. Oasis MCX柱-高效液相色谱/三重四极杆质谱联用法测定火锅底料中罂粟壳不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（23）： 8912-8919.
[22] 温海滨， 熊含鸿， 梁旭霞， 等. 超高效液相色谱-三重四级杆质谱法测定猪肉中氯霉素残留量的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（16）： 5448-5454.
[23] 国家质量监督检验检疫总局. 常用玻璃量器： JJG 196—2006[S]. 北京： 中国计量出版社， 2007.
[24] 段路路， 黄婧， 王凯越. HPLC法测定水溶性肥料植物生长调节剂的不确定度评定[J]. 中国农业科技导报， 2020， 22（9）： 169-178.
[25] 李文杰， 陈涛， 倪建秀， 等. 超高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定水产品中氟苯尼考及其代谢物残留量的不确定度评定[J]. 食品安全质量检测学报， 2020， 11（21）： 7927-7934. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.21.044.
[26] CHEN W Z. Evaluation of measurement uncertainty of impact resistance of ceramic brick[C]//2020 International Conference on Energy， Environment and Bioengineering， Sanya， China， January 10-12， 2020.
[27] 徐列兵， 郭强， 贾煜， 等. 气相色谱-质谱法测定食用植物油中短链脂肪酸的测量不确定度评定[J]. 化学分析计量，2021， 30（1）： 87-91. DOI：10.3969/j.issn.1008-6145.2021.01.018.
[28] 潘城， 胡朝阳， 吴凌， 等. 高效液相色谱法测定蔬菜中异菌脲残留量的不确定度分析[J]. 食品科学， 2017， 38（24）： 235-240. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201724038.
[29] 陆春胜， 马莉， 陈云忠. 能力验证样品中玉米赤霉烯酮含量测定的不确定度评定[J]. 分析仪器， 2020（6）： 100-105. DOI：10.3969/j.issn.1001-232x.2020.06.019.
收稿日期：2021-05-11
基金项目：河北省市场监督管理局科技计划项目（2020ZD08）
第一作者简介：赵盼（1983—）（ORCID： 0000-0001-6883-3058），女，工程师，学士，研究方向为食品质量安全。
E-mail： [email protected]
*通信作者简介：郭丽敏（1970—）（ORCID： 0000-0003-2191-9916），女，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品质量安全。E-mail： [email protected]