论文部分内容阅读
摘要 目的：比较不同提取工艺的黄芪多糖提取率。方法：选用超声波辅助提取法对黄芪多糖进行提取，比较正交实验最优提取工艺和响应面试验最优提取工艺的提取率。结果：经由响应面优化得出：最优提取时间22 min，最优提取温度50 ℃，最优料液比16∶1（mL/g），理论提取率为9.93%;经过正交设计优化得出：最优提取时间20 min，最优提取温度40 ℃，最优料液比15∶1（mL/g），理论提取率为9.56%。结论：经二种优化结果进行验证比较，研究结果表明响应面法优化结果更为准确、合理，更适宜推广。
关键词 黄芪多糖;正交优化;响应面优化;工艺比较;提取温度;提取时间;液料比;提取率
Comparison of Different Extraction Optimization Processes of Astragalus Polysaccharides
YU Ping，ZHAO Bao′e，LI Qian
（Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Science，Gansu Provincial Key Laboratory of Technical Innovation for Standardized Production of Chinese Medicinal Materials，Materials College of Agriculture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）
Abstract Objective：To compare the extraction rate of Astragalus polysaccharides under different extraction technologies.Methods：Astragalus polysaccharides were extracted by ultrasonic-assisted extraction method，and the extraction rate of the optimal extraction process of the orthogonal test and the optimal extraction process of the response surface test were compared.Results：Through response surface optimization，the optimal extraction time was 22 min，the optimal extraction temperature was 50 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 16∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.93%; After orthogonal design optimization，the optimal extraction time was 20 min，the optimal extraction temperature was 40 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 15∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.56%.Conclusion：After verification and comparison of 2 optimization results，the research results show that the response surface method optimization results are more accurate，reasonable and more suitable for promotion.
Keywords Astragalus polysaccharide; Orthogonal optimization; Response surface optimization; Process comparison; Extraction temperature; Extraction time; Liquid-to-material ratio; Extraction rate
中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.003
黄芪是中药方剂中最常用补益药之一，古代曾书写为“黄耆”，始见于《五十二病方》[1]，清代始，将“耆”字简写成“芪”字，在《神农本草经》中列为上品[2]。
黄芪是甘肃的道地药材，同时也是十大陇药之一，主要分布在甘肃、内蒙古、山西、东北等地。黄芪在防病治病实际应用过程中入药部位一般取自于豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪干燥根，黄芪主要药效成分为黄芪多糖类，黄芪皂苷类，黄芪黄酮类。它具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌之效[3]。近年来在防病治病上的需求量一直在增加[4]。黄芪多糖对人体具有免疫调节的功效，一般用于治疗免疫调节障碍等症，同时具有抗病毒、抗衰老、抗辐射及抗氧化等功效，应用前景十分广阔，因此具有开发为新的中药标准提取物的潜在价值，但以黄芪多糖含量为指标成分的研究报道较少[5-7]。本实验采用超声法辅助提取法，运用苯酚硫酸法对产自陇西黄芪进行多糖含量进行测定，把多糖作为正交优化和响应面优化的目标，为黄芪多糖在后续生产实践中的合理开发利用提供理论参考，同时也为黄芪多糖作为目标提取物的提取制备工艺提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 植物材料黄芪（购自兰州黄河药材市场，产自甘肃陇西）经甘肃农业大学农学院中草药教研室陈垣教授鉴定为中药黄芪;D-无水葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸均为分析纯。
HH-S2数显恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司）;离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）;电子天平（慈溪市天东衡器厂，型号：HX203T）;紫外可见分光光度计（岛津企业（中国）有限公司）;超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 多糖提取方法 黄芪饮片经干燥后粉碎，过40目筛，取10 g黄芪粉末并按设计液料比加纯水，按设计的相应提取温度和提取时间进行超声提取，经纱布或脱脂棉滤过后浓缩至20 mL，加入3倍体积无水乙醇静置数小时，置冰箱中过夜沉淀，然后于离心机离心最后干燥，得到粗多糖[8]。
1.2.2 标准曲线绘制 把D-无水葡萄糖标准品粉末在105 ℃下干燥至恒重，并置于分析天平上进行精密称定，最后于100 mL容量瓶中定容至100 mL，最终得到浓度为100 μg/mL的D-无水葡萄糖标准溶液，作为对照品溶液，然后放置于4 ℃冰箱中保存备用。用移液管移取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL浓度为100 μg/mL的标准溶液，分别置于不同的试管之中，加蒸馏水至2.0 mL。再在试管中分别加入5%的苯酚溶液1.0 mL，然后迅速在试管中加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置于水浴锅中在40 ℃下保温加热15 min，取出后置于装有冷水的烧杯中冷却10 min，然后在490 nm处测定吸光度值并记录。浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线[9]，在0.010 0～0.100 0 mg/mL浓度范围内线性关系良好，求得出回归方程为：Y=0.0128X+0.02，R2=0.996。见表1。
1.2.3 精密度考察 精确吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.4 mL置试管中，按照标准曲线操作步骤重复测定5次，测得RSD%=1.73%。见表2。
1.2.4 供试品溶液制备 精确称取所得粗多糖约50 mg，加水溶解并定容至50 mL，摇匀后量取1 mL，加水稀释定容至250 mL，即为供试品溶液。采取苯酚-硫酸法对黄芪多糖进行含量测定，首先精密量取样品溶液0.5 mL移入10 mL容量瓶中加蒸馏水定容至10 mL。然后再精密量取1 mL置于试管中，按照标准曲线绘制的方法（1.3.2）操作，测得吸光度。用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度，同时采用蒸馏水做空白对照，进而计算出粗多糖浓度。
2.5 多糖含量测定计算 R（%）=[（C×V1×V2×N）/（V3×M×106）]×100
R为多糖提取率，C是比色液浓度（μg/mL），V1是比色液体积（mL），V2是定容体积（mL），N表示稀释倍数，V3是提供样品体积（mL），M为试验样品质量（g）[10]。
3 结果
3.1 最佳单因素条件
3.1.1 提取时间对多糖提取率的影响 经查阅文献把黄芪多糖提取料液比设计为20∶1（mL/g），把黄芪多糖提取温度设计为40 ℃，把黄芪多糖提取时间分别设计为10、20、30、40、50 min。然后进行时间因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图1。由此可知，黄芪多糖提取率在10～20 min之间递增，在20 min时达到较大值，之后稍有下降但趋于平缓，实验结果显示，提取时间过长可能会使多糖结构发生改变或破坏而影响多糖提取率使之下降，所以选择20 min为较佳的黄芪多糖提取时间[11]。
3.1.2 提取液料比对多糖提取率的影响 经查阅文献把黄芪多糖提取过程料液比分别设计为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），把提取温度设计为40 ℃、把时间设计为30 min进行液料比因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图2。由此可知，在5∶1（mL/g）增加到15∶1（mL/g）时黄芪多糖提取率呈递增趋势，在15∶1（mL/g）时达到最大值，之后稍有起伏，但提取率与15∶1（mL/g）相差不大，考虑到提取容器的容量问题选择15∶1（mL/g）为较佳液料比。
3.1.3 提取温度对多糖提取率的影响 将查阅文献把黄芪多糖料液比设计为20∶1，把黄芪多糖时间设计为30 min，同时选取温度为30、40、50、60、70 ℃进行温度因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图3。
如图3所示，多糖提取率在温度30～50 ℃之间呈明显递增，并在50 ℃时提取率达到最大，之后逐渐降低，研究结果表明温度过高可使糖分子结构发生改变而降低，因此选择50 ℃为较优提取温度[12]。综上实验结果，单因素最优条件为提取时间20 min，提取温度50 ℃，液料比15∶1（mL/g）。
3.2 响应面优化多糖提取工艺
3.2.1 Box-Behnken设计试验结果与分析 根据Box-Behnken原理进行试验设计，把多糖提取率作为响应值，结合单因素试验结果进行试验因素的水平范围的确定，软件Design-Expert 8.0.6，同时采用液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）进行三因素三水平的响应面试验设计。见表3。
根据表中设计的各因素水平进行试验，利用所得吸光度计算各种条件下的多糖提取率。見表4。
从表4分析可知，当把黄芪多糖的提取时间设定为20 min，提取温度设定为50 ℃，液料比设定为15∶1（mL/g）时黄芪多糖提取率最高，结果显示为10.43%。以黄芪多糖的多糖提取率（R）为响应值，采用Design-Expert8.0.6软件对黄芪多糖的提取时间、提取温度，液料比进行回归分析，所得回归模拟方程为： R=9.86+0.52A+0.68B+0.012C-0.46AB-0.49AC+0.42BC-1.88A2-1.23B2-0.29C2-0.56A2B-0.062A2C+0.070AB2。
经过对模型进行方差分析，得出的结果见表5、表6。
由表5可知，试验整体模型F=18.47，P=0.000 4，说明该模型有统计学意义（P<0.01），失拟项F=1.42，P=0.361 5，差异无统计学意义（P>0.05），结合表6中多元相关系数R2=0.959 6，调整后R2Adj=0.907 7，说明模型拟合良好，该实验设计合理，可用此模型进行黄芪多糖的提取工艺的分析和预测。从F值可以判断出各因素对黄芪多糖提取率影响程度为：A（提取液料比）>B（提取时间）>C（提取温度）。
3.2.2 响应面及等高线结果（工艺优化最佳条件） 依据所得二次线性回归方程，采用Design-Expert8.0.6软件绘制出3个因素对糖提取率交互影响的三维响应曲面图和等高线图。见图4。
由图4可知，当提取温度一定时，在液料比不断增加的情况下，黄芪多糖提取率呈现出先增大后趋于平缓的趋势，相反，当液料比保持一定时，随着提取温度的升高，黄芪多糖提取率同样呈现出先平缓增大后减小的趋势，说明液料比大于温度对多糖提率影响[13]。由图5可知，当提取时间一定时，随着液料比的增大，黄芪多糖提取率逐渐增大后趋于平缓，反之亦然，当液料比一定时，随着提取时间的延长，黄芪多糖提取率同样呈现出先增大后减小的趋势。由图6可知，当提取温度一定处于一定的水平时，黄芪多糖提取率随着提取时间的推移呈现先增大后减小，反之亦然，当提取时间处于一定的水平时，黄芪多糖提取率跟着提取温度先增大后减小。
由效应曲面图a、c、e可知响应面具有最高点，从响应面的陡峭程度和等高线的椭圆程度来看，提取的液料比对黄芪多糖提取率的影响最显著，液料比和温度的交互作用显示出很明显的作用，时间和温度的交互作用也显示出相对明显的作用，料液比和时间的交互作用显示较弱的作用[13]。这与表5、6中的方差分析结果相一致。
3.2.3 响应面优化结果及验证性实验Design-Expert 根据对回归方程进行分析得到黄芪多糖提取率最大时对应的最佳提取条件为：液料比15.7∶1，提取时间21.25 min，提取温度49.40 ℃，且黄芪多糖理论提取率为9.93%，结合实际情况确定最终优化方案为：液料比16∶1，提取时间22 min，提取温度50 ℃。在根据图表中显示出的最佳工艺条件，进行3次平行验证性实验，进而分别得到的多糖提取率分别为9.36%、8.98%、9.52%，平均值为9.29%，与预测值的相近。由此可知，该模型的预测性良好，此工艺提取黄芪多糖是可靠的，有较大实用价值。
3.3 正交试验设计优化多糖提取工艺
3.3.1 正交试验设计 参考前期单因素实验考察结果对黄芪多糖提取率进行实验设计，用多糖提取率作为正交实验优劣评价指标，分别从提取时间、提取温度、料液比3个因素对多糖提取率进行影响程度的考察，使用正交试验法设计多糖提取工艺，设置的因素水平见表7。
3.3.2 试验结果 L9（33）正交试验直观分析结果。见表8。根据R值[14]大小，可得各因素对黄芪多糖提取影响程度大小为：C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）。
由表9可知，FA1=58.581，FB1=17.928，FC1=73.639，PA1=0.017<0.05，PC1=0.013<0.05，因此可认为因素A1（提取时间）、C1（提取液料比）均有统计学意义，为主要影响因素，PB1=0.053>0.05，因此因素B1（提取温度）无统计学意义，为次要影响因素，即各因素影响程度大小为C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）。
R2=0.993（调整后R2=0.974），以P<0.05为差异有统计学意义
3.3.3 正交设计优化结果及验证性试验 由表9可知，各因素对黄芪多糖提取率影响程度大小为C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）;结合表8中各因素Ki值[14]确定黄芪多糖最佳提取条件为A1，2、B1，1、C1，2，即提取时间为20 min，提取温度为40 ℃，提取液料比为15∶1（mL/g）。通过3组平行试验验证，得到在最优提取条件下多糖提取率分别为9.26%，8.46%，8.70%，平均值为8.81%，与正交试验结果几近一致，表明此提取条件稳定、可靠。
3.4 优化工艺结果比较 由表10可知，SPSS正交实验法优化得出的最优黄芪多糖提取条件为：提取时间20 min，料液比15∶1（mL/g），提取温度40 ℃，黄芪多糖理论预测提取率为9.56%，实际提取率为8.81%，偏差为0.75%。经响应面优化得出黄芪多糖最优提取条件为：提取时间22 min，提取温度50 ℃，料液比16∶1（mL/g），黄芪多糖理论预测提取率为9.93%，实际实验提取率为9.29%，偏差为0.64%。就提取率和偏差度而言，二种优化结果均可，具体哪一种更为符合要求需视具体情况和要求而定。
4 讨论
4.1 本实验采用超声提取法，运用苯酚硫酸法对多糖含量进行测定，作为正交优化和響应面优化的指标。通过对响应面试验设计优化得出的最佳提取工艺和正交试验设计优化得出的最佳提取工艺的比较，可以看出二种方法优化的最优工艺条件除温度相差10 ℃外，其他条件几乎趋于一致，而且在响应面优化和正交实验优化二种优化结果中，温度对提取率的影响小于液料比和时间对提取率的影响，在不考虑生产能耗等问题的情况下，二种优化结果均可作为提取工艺的选择依据。 4.2 就二种优化方法而言，与响应面法优化比较，正交法优化只能得到观察组中的最佳组合，无法考察或预测观察组以外的情况[15]。而响应面法建立的二次回归优化模型则能较好预测试验设置水平之外黄芪多糖的提取率，精确度也略优于正交试验设计法[16]。本实验中响应面法优化的工艺条件下得到的多糖提取率也略大于正交试验法得到的多糖提取率，从这些方面来看，选择响应面优化结果作为最佳工艺生产条件更为合理，更值得推广。
4.3 多糖是黄芪药材的重要活性成分之一，具有多种多样的生物功效和临床应用效果，应用前景十分广阔，具有开发为新的中药标准提取物的潜在价值。黄芪多糖提取的方法目前已经普遍运用的有大孔树脂提取法、水提纯沉法、碱水提法、碱醇提法、超微粉碎技术提取等，但都存在耗能高，高级结构容易发生改变等缺点[17-18]。虽然超声法单独提取并不常用，但在能耗方面少于其他方法。以黄芪多糖含量为指标成分的研究报道也较少，水提醇沉法作为一种可取的多糖提取方法，得到了工业化生产广泛应用[19]。随着工业化生产技术水平的发展和黄芪多糖利用价值如药用价值、食用价值、美容价值等的不断发展应用，超声辅助提取黄芪多糖也将成为工业化生产的选择方向[4]。本实验采用超声法提取、二种优化设计方法比较所得到的最优黄芪多糖提取条件，可为其提供实验依据，对黄芪药材的质量控制也具有重要的意义。
参考文献
[1]严健民.五十二病方注补译[M].北京：中国古籍出版社，2005：139-141.
[2]佚名.神农本草经[M].尚志钧，校注.北京：学苑出版社，2008：111.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中药医药科技出版社，2015：25.
[4]张晓霞.陇西县黄芪产业发展研究[D].兰州：甘肃农业大学，2011.
[5]Shao P，Zhao LH，Zhi-Chen，et al.Regulation on maturation and function of dendritic cells by Astragalus mongholicus polysaccharides[J].Int Immunopharmacol，2006，6（7）：1161-1166.
[6]Yu DH，Bao YM，Wei CL，et al.Studies of chemical constituents and their antioxidant activities from Astragalus mongholicus Bunge[J].Biomed Environ Sci，2005，18（5）：297-301.
[7]呂琴，赵文晓，王世军，等.黄芪活血功效及现代药理学研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（9）：215-224.
[8]梁子敬，张景艳，冯海鹏，等.响应面优化黄芪多糖的提取工艺[J].食品研究与开发，2018，39（21）：72-76.
[9]于晓辉，刘自扬，杨劲松，等.薄层色谱法与苯酚硫酸法联用控制黄芪多糖粗粉质量[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7312-7314.
[10]彭雪娇，黄林华，王华，等.柑橘加工废渣糖蜜糖分的分离提取及含量测定[J].食品与发酵工业，2017，43（5）：247-254.
[11]宋庆燕，杨相，张鲁，等.响应面法优化黄芪总多糖超声提取工艺[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（2）：44-47.
[12]杨晓杰，王世佳，李旭业.温度对生姜多糖提取率及抗氧化活性的影响[J].中国调味品，2018，43（3）：6-8.
[13]姚思扬，赵春莉，刘子平，等.响应面法优化草莓品种红颜离体繁殖的增殖条件[J].江苏农业科学，2019，47（23）：88-91.
[14]张亚环，陈萍，王小芳.正交试验法优选黄芪多糖的水提工艺研究[J].化学世界，2007（6）：345-347.
[15]缪伟伟，王志雄，石仝雨，等.响应曲面法与正交法在二氧化碳超临界萃取桑叶总黄酮中的比较[J].江苏农业科学，2017，45（18）：189-193.
[16]王茜，王啟之，时维静，等.响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较[J].安徽科技学院学报，2015，29（5）：24-31.
[17]韩真贤，张宇，张云杰，等.黄芪多糖三种提取工艺比较[J].黑龙江医药科学，2009，32（4）：72-73.
[18]刘卫东，王兰英，任建国，等.黄芪多糖的化学组成和提取方法研究进展[J].西北药学杂志，2010，25（2）：151-153.
[19]姜慧妍，严思敏，吴秋惠，等.多糖的新型制剂研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（19）：4582-4588.
（2020-07-05收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（31860102）;甘肃省自然科学基金项目（18JR3RA185）;甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目（GSAU-STS-2037）;甘肃农业大学人才引进专项（GSAU-RCZX201704）
作者简介：余萍（1995.05—），女，硕士研究生在读，研究方向：中药分析及质量评价，E-mail：[email protected]
通信作者：李欠（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：中药分析及质量评价，E-mail：[email protected]
关键词 黄芪多糖;正交优化;响应面优化;工艺比较;提取温度;提取时间;液料比;提取率
Comparison of Different Extraction Optimization Processes of Astragalus Polysaccharides
YU Ping，ZHAO Bao′e，LI Qian
（Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Science，Gansu Provincial Key Laboratory of Technical Innovation for Standardized Production of Chinese Medicinal Materials，Materials College of Agriculture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）
Abstract Objective：To compare the extraction rate of Astragalus polysaccharides under different extraction technologies.Methods：Astragalus polysaccharides were extracted by ultrasonic-assisted extraction method，and the extraction rate of the optimal extraction process of the orthogonal test and the optimal extraction process of the response surface test were compared.Results：Through response surface optimization，the optimal extraction time was 22 min，the optimal extraction temperature was 50 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 16∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.93%; After orthogonal design optimization，the optimal extraction time was 20 min，the optimal extraction temperature was 40 ℃，the optimal material-to-liquid ratio was 15∶1（mL/g），and the theoretical extraction rate was 9.56%.Conclusion：After verification and comparison of 2 optimization results，the research results show that the response surface method optimization results are more accurate，reasonable and more suitable for promotion.
Keywords Astragalus polysaccharide; Orthogonal optimization; Response surface optimization; Process comparison; Extraction temperature; Extraction time; Liquid-to-material ratio; Extraction rate
中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.003
黄芪是中药方剂中最常用补益药之一，古代曾书写为“黄耆”，始见于《五十二病方》[1]，清代始，将“耆”字简写成“芪”字，在《神农本草经》中列为上品[2]。
黄芪是甘肃的道地药材，同时也是十大陇药之一，主要分布在甘肃、内蒙古、山西、东北等地。黄芪在防病治病实际应用过程中入药部位一般取自于豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪干燥根，黄芪主要药效成分为黄芪多糖类，黄芪皂苷类，黄芪黄酮类。它具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌之效[3]。近年来在防病治病上的需求量一直在增加[4]。黄芪多糖对人体具有免疫调节的功效，一般用于治疗免疫调节障碍等症，同时具有抗病毒、抗衰老、抗辐射及抗氧化等功效，应用前景十分广阔，因此具有开发为新的中药标准提取物的潜在价值，但以黄芪多糖含量为指标成分的研究报道较少[5-7]。本实验采用超声法辅助提取法，运用苯酚硫酸法对产自陇西黄芪进行多糖含量进行测定，把多糖作为正交优化和响应面优化的目标，为黄芪多糖在后续生产实践中的合理开发利用提供理论参考，同时也为黄芪多糖作为目标提取物的提取制备工艺提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 植物材料黄芪（购自兰州黄河药材市场，产自甘肃陇西）经甘肃农业大学农学院中草药教研室陈垣教授鉴定为中药黄芪;D-无水葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸均为分析纯。
HH-S2数显恒温水浴锅（江苏正基仪器有限公司）;离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）;电子天平（慈溪市天东衡器厂，型号：HX203T）;紫外可见分光光度计（岛津企业（中国）有限公司）;超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 多糖提取方法 黄芪饮片经干燥后粉碎，过40目筛，取10 g黄芪粉末并按设计液料比加纯水，按设计的相应提取温度和提取时间进行超声提取，经纱布或脱脂棉滤过后浓缩至20 mL，加入3倍体积无水乙醇静置数小时，置冰箱中过夜沉淀，然后于离心机离心最后干燥，得到粗多糖[8]。
1.2.2 标准曲线绘制 把D-无水葡萄糖标准品粉末在105 ℃下干燥至恒重，并置于分析天平上进行精密称定，最后于100 mL容量瓶中定容至100 mL，最终得到浓度为100 μg/mL的D-无水葡萄糖标准溶液，作为对照品溶液，然后放置于4 ℃冰箱中保存备用。用移液管移取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL浓度为100 μg/mL的标准溶液，分别置于不同的试管之中，加蒸馏水至2.0 mL。再在试管中分别加入5%的苯酚溶液1.0 mL，然后迅速在试管中加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置于水浴锅中在40 ℃下保温加热15 min，取出后置于装有冷水的烧杯中冷却10 min，然后在490 nm处测定吸光度值并记录。浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线[9]，在0.010 0～0.100 0 mg/mL浓度范围内线性关系良好，求得出回归方程为：Y=0.0128X+0.02，R2=0.996。见表1。
1.2.3 精密度考察 精确吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.4 mL置试管中，按照标准曲线操作步骤重复测定5次，测得RSD%=1.73%。见表2。
1.2.4 供试品溶液制备 精确称取所得粗多糖约50 mg，加水溶解并定容至50 mL，摇匀后量取1 mL，加水稀释定容至250 mL，即为供试品溶液。采取苯酚-硫酸法对黄芪多糖进行含量测定，首先精密量取样品溶液0.5 mL移入10 mL容量瓶中加蒸馏水定容至10 mL。然后再精密量取1 mL置于试管中，按照标准曲线绘制的方法（1.3.2）操作，测得吸光度。用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度，同时采用蒸馏水做空白对照，进而计算出粗多糖浓度。
2.5 多糖含量测定计算 R（%）=[（C×V1×V2×N）/（V3×M×106）]×100
R为多糖提取率，C是比色液浓度（μg/mL），V1是比色液体积（mL），V2是定容体积（mL），N表示稀释倍数，V3是提供样品体积（mL），M为试验样品质量（g）[10]。
3 结果
3.1 最佳单因素条件
3.1.1 提取时间对多糖提取率的影响 经查阅文献把黄芪多糖提取料液比设计为20∶1（mL/g），把黄芪多糖提取温度设计为40 ℃，把黄芪多糖提取时间分别设计为10、20、30、40、50 min。然后进行时间因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图1。由此可知，黄芪多糖提取率在10～20 min之间递增，在20 min时达到较大值，之后稍有下降但趋于平缓，实验结果显示，提取时间过长可能会使多糖结构发生改变或破坏而影响多糖提取率使之下降，所以选择20 min为较佳的黄芪多糖提取时间[11]。
3.1.2 提取液料比对多糖提取率的影响 经查阅文献把黄芪多糖提取过程料液比分别设计为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），把提取温度设计为40 ℃、把时间设计为30 min进行液料比因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图2。由此可知，在5∶1（mL/g）增加到15∶1（mL/g）时黄芪多糖提取率呈递增趋势，在15∶1（mL/g）时达到最大值，之后稍有起伏，但提取率与15∶1（mL/g）相差不大，考虑到提取容器的容量问题选择15∶1（mL/g）为较佳液料比。
3.1.3 提取温度对多糖提取率的影响 将查阅文献把黄芪多糖料液比设计为20∶1，把黄芪多糖时间设计为30 min，同时选取温度为30、40、50、60、70 ℃进行温度因素对黄芪多糖提取率影响试验。见图3。
如图3所示，多糖提取率在温度30～50 ℃之间呈明显递增，并在50 ℃时提取率达到最大，之后逐渐降低，研究结果表明温度过高可使糖分子结构发生改变而降低，因此选择50 ℃为较优提取温度[12]。综上实验结果，单因素最优条件为提取时间20 min，提取温度50 ℃，液料比15∶1（mL/g）。
3.2 响应面优化多糖提取工艺
3.2.1 Box-Behnken设计试验结果与分析 根据Box-Behnken原理进行试验设计，把多糖提取率作为响应值，结合单因素试验结果进行试验因素的水平范围的确定，软件Design-Expert 8.0.6，同时采用液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）进行三因素三水平的响应面试验设计。见表3。
根据表中设计的各因素水平进行试验，利用所得吸光度计算各种条件下的多糖提取率。見表4。
从表4分析可知，当把黄芪多糖的提取时间设定为20 min，提取温度设定为50 ℃，液料比设定为15∶1（mL/g）时黄芪多糖提取率最高，结果显示为10.43%。以黄芪多糖的多糖提取率（R）为响应值，采用Design-Expert8.0.6软件对黄芪多糖的提取时间、提取温度，液料比进行回归分析，所得回归模拟方程为： R=9.86+0.52A+0.68B+0.012C-0.46AB-0.49AC+0.42BC-1.88A2-1.23B2-0.29C2-0.56A2B-0.062A2C+0.070AB2。
经过对模型进行方差分析，得出的结果见表5、表6。
由表5可知，试验整体模型F=18.47，P=0.000 4，说明该模型有统计学意义（P<0.01），失拟项F=1.42，P=0.361 5，差异无统计学意义（P>0.05），结合表6中多元相关系数R2=0.959 6，调整后R2Adj=0.907 7，说明模型拟合良好，该实验设计合理，可用此模型进行黄芪多糖的提取工艺的分析和预测。从F值可以判断出各因素对黄芪多糖提取率影响程度为：A（提取液料比）>B（提取时间）>C（提取温度）。
3.2.2 响应面及等高线结果（工艺优化最佳条件） 依据所得二次线性回归方程，采用Design-Expert8.0.6软件绘制出3个因素对糖提取率交互影响的三维响应曲面图和等高线图。见图4。
由图4可知，当提取温度一定时，在液料比不断增加的情况下，黄芪多糖提取率呈现出先增大后趋于平缓的趋势，相反，当液料比保持一定时，随着提取温度的升高，黄芪多糖提取率同样呈现出先平缓增大后减小的趋势，说明液料比大于温度对多糖提率影响[13]。由图5可知，当提取时间一定时，随着液料比的增大，黄芪多糖提取率逐渐增大后趋于平缓，反之亦然，当液料比一定时，随着提取时间的延长，黄芪多糖提取率同样呈现出先增大后减小的趋势。由图6可知，当提取温度一定处于一定的水平时，黄芪多糖提取率随着提取时间的推移呈现先增大后减小，反之亦然，当提取时间处于一定的水平时，黄芪多糖提取率跟着提取温度先增大后减小。
由效应曲面图a、c、e可知响应面具有最高点，从响应面的陡峭程度和等高线的椭圆程度来看，提取的液料比对黄芪多糖提取率的影响最显著，液料比和温度的交互作用显示出很明显的作用，时间和温度的交互作用也显示出相对明显的作用，料液比和时间的交互作用显示较弱的作用[13]。这与表5、6中的方差分析结果相一致。
3.2.3 响应面优化结果及验证性实验Design-Expert 根据对回归方程进行分析得到黄芪多糖提取率最大时对应的最佳提取条件为：液料比15.7∶1，提取时间21.25 min，提取温度49.40 ℃，且黄芪多糖理论提取率为9.93%，结合实际情况确定最终优化方案为：液料比16∶1，提取时间22 min，提取温度50 ℃。在根据图表中显示出的最佳工艺条件，进行3次平行验证性实验，进而分别得到的多糖提取率分别为9.36%、8.98%、9.52%，平均值为9.29%，与预测值的相近。由此可知，该模型的预测性良好，此工艺提取黄芪多糖是可靠的，有较大实用价值。
3.3 正交试验设计优化多糖提取工艺
3.3.1 正交试验设计 参考前期单因素实验考察结果对黄芪多糖提取率进行实验设计，用多糖提取率作为正交实验优劣评价指标，分别从提取时间、提取温度、料液比3个因素对多糖提取率进行影响程度的考察，使用正交试验法设计多糖提取工艺，设置的因素水平见表7。
3.3.2 试验结果 L9（33）正交试验直观分析结果。见表8。根据R值[14]大小，可得各因素对黄芪多糖提取影响程度大小为：C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）。
由表9可知，FA1=58.581，FB1=17.928，FC1=73.639，PA1=0.017<0.05，PC1=0.013<0.05，因此可认为因素A1（提取时间）、C1（提取液料比）均有统计学意义，为主要影响因素，PB1=0.053>0.05，因此因素B1（提取温度）无统计学意义，为次要影响因素，即各因素影响程度大小为C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）。
R2=0.993（调整后R2=0.974），以P<0.05为差异有统计学意义
3.3.3 正交设计优化结果及验证性试验 由表9可知，各因素对黄芪多糖提取率影响程度大小为C1（提取液料比）>A1（提取时间）>B1（提取温度）;结合表8中各因素Ki值[14]确定黄芪多糖最佳提取条件为A1，2、B1，1、C1，2，即提取时间为20 min，提取温度为40 ℃，提取液料比为15∶1（mL/g）。通过3组平行试验验证，得到在最优提取条件下多糖提取率分别为9.26%，8.46%，8.70%，平均值为8.81%，与正交试验结果几近一致，表明此提取条件稳定、可靠。
3.4 优化工艺结果比较 由表10可知，SPSS正交实验法优化得出的最优黄芪多糖提取条件为：提取时间20 min，料液比15∶1（mL/g），提取温度40 ℃，黄芪多糖理论预测提取率为9.56%，实际提取率为8.81%，偏差为0.75%。经响应面优化得出黄芪多糖最优提取条件为：提取时间22 min，提取温度50 ℃，料液比16∶1（mL/g），黄芪多糖理论预测提取率为9.93%，实际实验提取率为9.29%，偏差为0.64%。就提取率和偏差度而言，二种优化结果均可，具体哪一种更为符合要求需视具体情况和要求而定。
4 讨论
4.1 本实验采用超声提取法，运用苯酚硫酸法对多糖含量进行测定，作为正交优化和響应面优化的指标。通过对响应面试验设计优化得出的最佳提取工艺和正交试验设计优化得出的最佳提取工艺的比较，可以看出二种方法优化的最优工艺条件除温度相差10 ℃外，其他条件几乎趋于一致，而且在响应面优化和正交实验优化二种优化结果中，温度对提取率的影响小于液料比和时间对提取率的影响，在不考虑生产能耗等问题的情况下，二种优化结果均可作为提取工艺的选择依据。 4.2 就二种优化方法而言，与响应面法优化比较，正交法优化只能得到观察组中的最佳组合，无法考察或预测观察组以外的情况[15]。而响应面法建立的二次回归优化模型则能较好预测试验设置水平之外黄芪多糖的提取率，精确度也略优于正交试验设计法[16]。本实验中响应面法优化的工艺条件下得到的多糖提取率也略大于正交试验法得到的多糖提取率，从这些方面来看，选择响应面优化结果作为最佳工艺生产条件更为合理，更值得推广。
4.3 多糖是黄芪药材的重要活性成分之一，具有多种多样的生物功效和临床应用效果，应用前景十分广阔，具有开发为新的中药标准提取物的潜在价值。黄芪多糖提取的方法目前已经普遍运用的有大孔树脂提取法、水提纯沉法、碱水提法、碱醇提法、超微粉碎技术提取等，但都存在耗能高，高级结构容易发生改变等缺点[17-18]。虽然超声法单独提取并不常用，但在能耗方面少于其他方法。以黄芪多糖含量为指标成分的研究报道也较少，水提醇沉法作为一种可取的多糖提取方法，得到了工业化生产广泛应用[19]。随着工业化生产技术水平的发展和黄芪多糖利用价值如药用价值、食用价值、美容价值等的不断发展应用，超声辅助提取黄芪多糖也将成为工业化生产的选择方向[4]。本实验采用超声法提取、二种优化设计方法比较所得到的最优黄芪多糖提取条件，可为其提供实验依据，对黄芪药材的质量控制也具有重要的意义。
参考文献
[1]严健民.五十二病方注补译[M].北京：中国古籍出版社，2005：139-141.
[2]佚名.神农本草经[M].尚志钧，校注.北京：学苑出版社，2008：111.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中药医药科技出版社，2015：25.
[4]张晓霞.陇西县黄芪产业发展研究[D].兰州：甘肃农业大学，2011.
[5]Shao P，Zhao LH，Zhi-Chen，et al.Regulation on maturation and function of dendritic cells by Astragalus mongholicus polysaccharides[J].Int Immunopharmacol，2006，6（7）：1161-1166.
[6]Yu DH，Bao YM，Wei CL，et al.Studies of chemical constituents and their antioxidant activities from Astragalus mongholicus Bunge[J].Biomed Environ Sci，2005，18（5）：297-301.
[7]呂琴，赵文晓，王世军，等.黄芪活血功效及现代药理学研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（9）：215-224.
[8]梁子敬，张景艳，冯海鹏，等.响应面优化黄芪多糖的提取工艺[J].食品研究与开发，2018，39（21）：72-76.
[9]于晓辉，刘自扬，杨劲松，等.薄层色谱法与苯酚硫酸法联用控制黄芪多糖粗粉质量[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7312-7314.
[10]彭雪娇，黄林华，王华，等.柑橘加工废渣糖蜜糖分的分离提取及含量测定[J].食品与发酵工业，2017，43（5）：247-254.
[11]宋庆燕，杨相，张鲁，等.响应面法优化黄芪总多糖超声提取工艺[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（2）：44-47.
[12]杨晓杰，王世佳，李旭业.温度对生姜多糖提取率及抗氧化活性的影响[J].中国调味品，2018，43（3）：6-8.
[13]姚思扬，赵春莉，刘子平，等.响应面法优化草莓品种红颜离体繁殖的增殖条件[J].江苏农业科学，2019，47（23）：88-91.
[14]张亚环，陈萍，王小芳.正交试验法优选黄芪多糖的水提工艺研究[J].化学世界，2007（6）：345-347.
[15]缪伟伟，王志雄，石仝雨，等.响应曲面法与正交法在二氧化碳超临界萃取桑叶总黄酮中的比较[J].江苏农业科学，2017，45（18）：189-193.
[16]王茜，王啟之，时维静，等.响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较[J].安徽科技学院学报，2015，29（5）：24-31.
[17]韩真贤，张宇，张云杰，等.黄芪多糖三种提取工艺比较[J].黑龙江医药科学，2009，32（4）：72-73.
[18]刘卫东，王兰英，任建国，等.黄芪多糖的化学组成和提取方法研究进展[J].西北药学杂志，2010，25（2）：151-153.
[19]姜慧妍，严思敏，吴秋惠，等.多糖的新型制剂研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（19）：4582-4588.
（2020-07-05收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（31860102）;甘肃省自然科学基金项目（18JR3RA185）;甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目（GSAU-STS-2037）;甘肃农业大学人才引进专项（GSAU-RCZX201704）
作者简介：余萍（1995.05—），女，硕士研究生在读，研究方向：中药分析及质量评价，E-mail：[email protected]
通信作者：李欠（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：中药分析及质量评价，E-mail：[email protected]