【摘 要】
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目的 建立轮状病毒(rotavirus,RV)微滴数字PCR(RT-ddPCR)检测方法,并进行优化及验证,同时与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法进行比较.方法 根据NSP5基因保守序列特征,筛选引物和探针,建立RV的RT-ddPCR检测方法,并优化退火温度(55.1、56.0、57.2、58.1、58.9、59.9、61.0、62.1、63.2、64.1、64.9℃)、引物浓度(40、60、100、120 nmol/L)及探针浓度(60、70、80、90、100 nmol/L),同时验证方法的特异
【机 构】
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西安培华学院医学院,陕西西安710125
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目的 建立轮状病毒(rotavirus,RV)微滴数字PCR(RT-ddPCR)检测方法,并进行优化及验证,同时与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法进行比较.方法 根据NSP5基因保守序列特征,筛选引物和探针,建立RV的RT-ddPCR检测方法,并优化退火温度(55.1、56.0、57.2、58.1、58.9、59.9、61.0、62.1、63.2、64.1、64.9℃)、引物浓度(40、60、100、120 nmol/L)及探针浓度(60、70、80、90、100 nmol/L),同时验证方法的特异性、线性范围、精密性及灵敏性.采用RT-ddPCR和RT-qPCR法同时检测150份腹泻患儿的粪便样本,计算两者符合率.结果 确定RT-ddPCR法最适退火温度为61.0℃,最适引物及探针浓度分别为100和60 nmol/L.优化的RT-ddPCR法检测RV有阳性微滴生成,其他病毒无阳性液滴生成,且RV阳性与阴性微滴簇显著分开,两者之间弥散微滴较少;RNA核酸标准物质在4.95～49000 copies/μL范围内,与检测值呈良好的线性关系,线性方程为y=1.1000x-44.2570,R2为1.0000;RNA核酸标准物质理论拷贝数为24.5～49000 copies/μL时,精密性检测的RSD为1.75％～5.24％;最低检测稀释倍数为5×107,即拷贝数为2.45 copies/μL.RT-ddPCR和RT-qPCR法检测150份腹泻患儿的粪便样本,98份为阳性,52份为阴性,两者符合率为100％.结论 成功建立了RV的RT-ddPCR检测方法,该方法具有良好的特异性及精密性,可用于RV的临床快速检测.
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