【摘 要】
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目的研究在非β细胞中表达成熟胰岛素,探索替代胰岛素注射或胰岛移植治疗1型糖尿病的方法 .方法采用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extention, gene SOEing
【机 构】
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复旦大学附属中山医院普外科,国家人类基因组南方中心
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目的研究在非β细胞中表达成熟胰岛素,探索替代胰岛素注射或胰岛移植治疗1型糖尿病的方法 .方法采用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extention, gene SOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的cDNA,并于C肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg.将获得的突变体重组表达载体PcDNA3.1/C,通过脂质体法转染体外培养的Hela,293,和L02细胞,G418筛选L02细胞.同时用放射免疫和免疫荧光的方法监测细胞内外胰岛素的表达水平.结果成功地对胰岛素原cDNA的三个位点进行了突变,空载体转染的细胞无胰岛素表达.而在转染突变后胰岛素原基因cDNA的细胞培养液中胰岛素的表达量各不相同:Hela 和293细胞的暂态表达量分别为8.45～188.00?μIU/2.0×106 cells*d-1和159.88～242.14 ?μIU/2.0×106 cells*d-1, 筛选出的L02各细胞株的表达量为2.56～61. 95?μIU/2.0×106 cells*d-1;免疫荧光显示L02细胞浆内有囊泡状分泌颗粒 .结论突变的胰岛素原cDNA能成功转染非胰岛β细胞并表达胰岛素,为进一步开展糖尿病的基因治疗研究奠定了基础.
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