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摘要 [目的]诊断疑似患有克雷伯氏杆菌病的发病鸡群。[方法]通过采取病鸡肝脏和脑组织，接种于胰蛋白胨琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、兔血琼脂培养基，培养出疑似克雷伯氏杆菌菌落，革兰氏染色发现该菌属于革兰氏阴性菌，将菌落进行溶血试验和生化试验。[结果]初步判断该菌为克雷伯氏杆菌。药敏试验中发现该菌对庆大霉素、妥布霉素、恩诺沙星、阿米卡星表现较敏感；对阿莫西林、卡那霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、多黏菌素、四环素有极强的耐药性；对于红霉素、新霉素的敏感性介于两者之间。[结论]药敏试验为治疗该菌提供了大致方向，同时提醒抗生素类药物切不可滥用，以免产生耐药性。
关键词 克雷伯氏杆菌；生化试验；药敏
中图分类号 S855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0092-03
Abstract [Objective] To diagnose the chickens suspected of having Klebsiella brucellosis. [Method] By using the liver and brain tissue of the diseased chicken， we inoculated in tryptone agar medium， MacConkeyagar medium， SS agar medium and rabbit blood agar medium to culture the suspected Klebsiella brucellosis colony. Gram stain found that the strain belonged to Gramnegative bacteria， the colony was subjected to hemolysis and biochemical tests. [Result] The results preliminarily reflected the suspected bacteria was Klebsiella brucellosis. The drug sensitivity test showed that the bacteria had strong drug resistance to amoxicillin， kanamycin，ampicillin，cefotaxime，ceftriaxone，polymyxin and tetracycline， more sensitivity to gentamicin， tobramycin， enrofloxacin， amikacin，and erythromycin， neomycin between them. [Conclusion] Drug sensitive test provides direction for treatment of the bacteria， but also reminds drugs must not be abused in order to avoid drug resistance.
Key words Klebsiella brucellosis；Biochemical tests；Drug sensitivity
雞克雷伯氏杆菌病是由克雷伯氏杆菌引起的一类以消化道或呼吸道疾病为主的传染性疾病。该病可通过消化道感染家禽使其发病，导致畜禽发生化脓性炎症，更甚者暴发败血症，引起小鸡一侧性或两侧性眼睑肿胀与视力障碍，发病率为38%～46%，死亡率达32%。该病的发生和鸡舍卫生环境不良有很大关系。该研究病鸡临床表现主要为腿关节肿胀，通过对该鸡的病样进行细菌分离与鉴定，结果初步判断该病鸡为克雷伯氏杆菌感染。
1 材料与方法
1.1 材料
组织病样为病鸡气囊、肝脏和支气管堵塞物等。培养基：胰蛋白胨琼脂培养基；SS琼脂培养基；麦康凯琼脂培养基；兔血琼脂培养基；三糖铁琼脂斜面培养基。主要试剂：革兰氏染色试剂；药敏纸片为庆大霉素等13种兽医常用抗生素（购自杭州微生物试剂有限公司）；细菌微量生化反应管（购自杭州滨和生物科技公司）。
1.2 方法
1.2.1 临床症状。
病鸡呆立，羽毛疏松零乱且毫无光泽感，排稀粪。眼睛流泪，低头缩颈。眼部有黏液脓性分泌物流出，一侧眼睑肿胀，甚至完全闭眼。一侧腿关节肿胀，瘫痪向一侧。
1.2.2 病理剖解。
对病禽进行剖解，可观察到关节局部肿胀，剪开有可见关节化脓；气囊炎浑浊；肠道出血，有脓性炎症分泌物；肝脏有小白点样物质；支气管有干酪样堵塞物（图1～3）。
1.2.3 细菌的分离。
无菌取自然病死的鸡支气管堵塞物接种于胰蛋白胨琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、兔血琼脂培养基上，37 ℃培养24 h后，察看细菌生长情况，再挑取单个有特征性的菌落接种于胰蛋白大豆肉汤液体培养基上进行纯培养，然后进行涂片镜检和生化鉴定[1-2]。
1.2.4 溶血试验。
用接种环挑取一环菌液在血平板上四区划线后，放入恒温箱37 ℃培养24 h后，察看其溶血现象。
1.2.5 生化试验。
在超净台上接种细菌微量生化反应管（乳糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、硫化氢、甘露醇、尿素、山梨醇、七叶苷、精氨酸双水解酶、西蒙氏枸櫞酸盐、氨基酸对照管），放进恒温箱中37 ℃培养6～48 h，观察结果。
三糖铁琼脂试验：用接种针挑取可疑菌落穿刺接种于该培养基底部，但不要刺穿并在斜面表面画S形曲线涂布整个斜面，将该培养基放入恒温箱中37 ℃培养18～24 h后，取出观察结果。 1.2.5 药敏试验。
按常规圆纸片扩散法进行药敏试验。取经过验证的克雷伯氏杆菌菌落，均匀涂布于该培养基上。用无菌镊子将临床上常用的13种药敏纸片均匀贴于琼脂表面并轻压，使药敏纸片能够与琼脂表面完全接触，接触后不要移动，放入恒温箱37 ℃培养16～18 h后察看结果，并量出抑菌圈直径，做好记录[3-4]。
2 结果与分析
2.1 细菌的分离结果
该菌在胰蛋白大豆肉汤琼脂培养基、兔血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基以及SS琼脂培养基上都可以生长。胰蛋白胨液体培养基中可见白色黏稠状沉淀，摇晃后呈均匀浑浊。在胰蛋白胨琼脂培养基上，菌落呈灰白色圆粒状凸起，边缘光滑整齐、闪亮、浓厚、湿润、黏稠，用接种环挑起易拉丝。在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色黏稠菌落，有扩散性，表面湿润；在SS琼脂培养基上，37 ℃培养24 h后培养基变成粉红色，形成粉红色黏稠菌落。该菌经过革兰氏染色在显微镜下表现为红色杆状菌，属于革兰氏阴性菌。
2.2 溶血试验结果
该菌株在兔血琼脂培养皿中培养后观察，菌落周围可见完全通透的溶血环，为β溶血[5]。说明该菌有极强的致病性。
2.3 细菌生化试验结果
观察细菌微量生化反应管，可见反应管颜色基本都发生变化（表1）。观察培养后的三糖铁琼脂斜面培养基，可见其底部产生气体，培养基的颜色由粉红色变成黄色，没有产生黑色物质。说明该菌能分解乳糖类产酸，分解葡萄糖产酸产气，不产生H2S[6]。综合上述各项结果初步判断其为克雷伯氏杆菌。
2.4 药敏试验结果
根据药物纸片周围的抑菌圈直径大小，判断该菌对13种抗生素药片的敏感程度，可分为敏感、中介和耐药[7-8]，结果见表2。
3 结论与讨论
克雷伯氏菌属的细菌多感染免疫力较为低下的家禽，安徽省在我国中部，夏季高温多雨，冬季天气寒冷，季节交替时温度变化快，这种季节变化使家禽应激反应剧烈，从而导致家禽免疫力下降，为各种动物源性微生物的生长提供了有利的条件，导致该病发生较为普遍[9]。
该次药敏试验结果表明，克雷伯氏杆菌对阿莫西林、卡那霉素、氨苄西林、四环素已产生高度耐药性，這种现象的出现很有可能是因为养殖户在饲养过程中滥用兽药导致，故这类药物已经不适合临床上用于克雷伯氏杆菌感染的经验性治疗。克雷伯氏杆菌对庆大霉素、妥布霉素、恩诺沙星、阿米卡星比较敏感，临床上可选用这类药治疗因克雷伯氏杆菌感染的疾病。另外，该菌对头孢噻肟、头孢曲松、多黏霉素、红霉素、新霉素的敏感性一般，可选择性适量用药，以避免日后该菌对这类药物也产生耐药性。药敏试验结果提醒畜主对药物切不可滥用，以免产生耐药性，最好通过药敏试验来筛选最敏感药物进行治疗。
参考文献
[1] 黄新新，陆承平.迟缓爱德华菌的外膜蛋白图谱及耐药性分析[J].微生物学报，2001，41（5）：630-631.
[2] 陆承平.兽医微生物学[M].5版.北京：中国农业出版社，2012：11.
[3] 崔治中.鸡病[M].北京：中国农业出版社，2009：68-69.
[4] 李云章.兽医专业毕业实习指导[M].北京：中国农业出版社，2013：73-74.
[5] 翟小敏.A+OSA污泥减量工艺微生物特性研究[D].重庆：重庆大学，2012.
[6] 刘杰，赵满仓.革兰染色的实验室质量管理及进展[J].解放军医药杂志，2013，25（5）：83-86.
[7] 周忠坤.沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].现代农业，2015（9）：94-95.
[8] 毕水莲.奇异变形杆菌可移动耐药基因岛研究[D].广州：华南理工大学，2011.
[9] 龙海波.小麦禾谷孢囊线虫β-1，4-内切葡聚糖酶和细胞壁扩展蛋白基因的克隆及功能分析[D].北京：中国农业科学院，2012.
关键词 克雷伯氏杆菌；生化试验；药敏
中图分类号 S855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0092-03
Abstract [Objective] To diagnose the chickens suspected of having Klebsiella brucellosis. [Method] By using the liver and brain tissue of the diseased chicken， we inoculated in tryptone agar medium， MacConkeyagar medium， SS agar medium and rabbit blood agar medium to culture the suspected Klebsiella brucellosis colony. Gram stain found that the strain belonged to Gramnegative bacteria， the colony was subjected to hemolysis and biochemical tests. [Result] The results preliminarily reflected the suspected bacteria was Klebsiella brucellosis. The drug sensitivity test showed that the bacteria had strong drug resistance to amoxicillin， kanamycin，ampicillin，cefotaxime，ceftriaxone，polymyxin and tetracycline， more sensitivity to gentamicin， tobramycin， enrofloxacin， amikacin，and erythromycin， neomycin between them. [Conclusion] Drug sensitive test provides direction for treatment of the bacteria， but also reminds drugs must not be abused in order to avoid drug resistance.
Key words Klebsiella brucellosis；Biochemical tests；Drug sensitivity
雞克雷伯氏杆菌病是由克雷伯氏杆菌引起的一类以消化道或呼吸道疾病为主的传染性疾病。该病可通过消化道感染家禽使其发病，导致畜禽发生化脓性炎症，更甚者暴发败血症，引起小鸡一侧性或两侧性眼睑肿胀与视力障碍，发病率为38%～46%，死亡率达32%。该病的发生和鸡舍卫生环境不良有很大关系。该研究病鸡临床表现主要为腿关节肿胀，通过对该鸡的病样进行细菌分离与鉴定，结果初步判断该病鸡为克雷伯氏杆菌感染。
1 材料与方法
1.1 材料
组织病样为病鸡气囊、肝脏和支气管堵塞物等。培养基：胰蛋白胨琼脂培养基；SS琼脂培养基；麦康凯琼脂培养基；兔血琼脂培养基；三糖铁琼脂斜面培养基。主要试剂：革兰氏染色试剂；药敏纸片为庆大霉素等13种兽医常用抗生素（购自杭州微生物试剂有限公司）；细菌微量生化反应管（购自杭州滨和生物科技公司）。
1.2 方法
1.2.1 临床症状。
病鸡呆立，羽毛疏松零乱且毫无光泽感，排稀粪。眼睛流泪，低头缩颈。眼部有黏液脓性分泌物流出，一侧眼睑肿胀，甚至完全闭眼。一侧腿关节肿胀，瘫痪向一侧。
1.2.2 病理剖解。
对病禽进行剖解，可观察到关节局部肿胀，剪开有可见关节化脓；气囊炎浑浊；肠道出血，有脓性炎症分泌物；肝脏有小白点样物质；支气管有干酪样堵塞物（图1～3）。
1.2.3 细菌的分离。
无菌取自然病死的鸡支气管堵塞物接种于胰蛋白胨琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、兔血琼脂培养基上，37 ℃培养24 h后，察看细菌生长情况，再挑取单个有特征性的菌落接种于胰蛋白大豆肉汤液体培养基上进行纯培养，然后进行涂片镜检和生化鉴定[1-2]。
1.2.4 溶血试验。
用接种环挑取一环菌液在血平板上四区划线后，放入恒温箱37 ℃培养24 h后，察看其溶血现象。
1.2.5 生化试验。
在超净台上接种细菌微量生化反应管（乳糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、硫化氢、甘露醇、尿素、山梨醇、七叶苷、精氨酸双水解酶、西蒙氏枸櫞酸盐、氨基酸对照管），放进恒温箱中37 ℃培养6～48 h，观察结果。
三糖铁琼脂试验：用接种针挑取可疑菌落穿刺接种于该培养基底部，但不要刺穿并在斜面表面画S形曲线涂布整个斜面，将该培养基放入恒温箱中37 ℃培养18～24 h后，取出观察结果。 1.2.5 药敏试验。
按常规圆纸片扩散法进行药敏试验。取经过验证的克雷伯氏杆菌菌落，均匀涂布于该培养基上。用无菌镊子将临床上常用的13种药敏纸片均匀贴于琼脂表面并轻压，使药敏纸片能够与琼脂表面完全接触，接触后不要移动，放入恒温箱37 ℃培养16～18 h后察看结果，并量出抑菌圈直径，做好记录[3-4]。
2 结果与分析
2.1 细菌的分离结果
该菌在胰蛋白大豆肉汤琼脂培养基、兔血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基以及SS琼脂培养基上都可以生长。胰蛋白胨液体培养基中可见白色黏稠状沉淀，摇晃后呈均匀浑浊。在胰蛋白胨琼脂培养基上，菌落呈灰白色圆粒状凸起，边缘光滑整齐、闪亮、浓厚、湿润、黏稠，用接种环挑起易拉丝。在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色黏稠菌落，有扩散性，表面湿润；在SS琼脂培养基上，37 ℃培养24 h后培养基变成粉红色，形成粉红色黏稠菌落。该菌经过革兰氏染色在显微镜下表现为红色杆状菌，属于革兰氏阴性菌。
2.2 溶血试验结果
该菌株在兔血琼脂培养皿中培养后观察，菌落周围可见完全通透的溶血环，为β溶血[5]。说明该菌有极强的致病性。
2.3 细菌生化试验结果
观察细菌微量生化反应管，可见反应管颜色基本都发生变化（表1）。观察培养后的三糖铁琼脂斜面培养基，可见其底部产生气体，培养基的颜色由粉红色变成黄色，没有产生黑色物质。说明该菌能分解乳糖类产酸，分解葡萄糖产酸产气，不产生H2S[6]。综合上述各项结果初步判断其为克雷伯氏杆菌。
2.4 药敏试验结果
根据药物纸片周围的抑菌圈直径大小，判断该菌对13种抗生素药片的敏感程度，可分为敏感、中介和耐药[7-8]，结果见表2。
3 结论与讨论
克雷伯氏菌属的细菌多感染免疫力较为低下的家禽，安徽省在我国中部，夏季高温多雨，冬季天气寒冷，季节交替时温度变化快，这种季节变化使家禽应激反应剧烈，从而导致家禽免疫力下降，为各种动物源性微生物的生长提供了有利的条件，导致该病发生较为普遍[9]。
该次药敏试验结果表明，克雷伯氏杆菌对阿莫西林、卡那霉素、氨苄西林、四环素已产生高度耐药性，這种现象的出现很有可能是因为养殖户在饲养过程中滥用兽药导致，故这类药物已经不适合临床上用于克雷伯氏杆菌感染的经验性治疗。克雷伯氏杆菌对庆大霉素、妥布霉素、恩诺沙星、阿米卡星比较敏感，临床上可选用这类药治疗因克雷伯氏杆菌感染的疾病。另外，该菌对头孢噻肟、头孢曲松、多黏霉素、红霉素、新霉素的敏感性一般，可选择性适量用药，以避免日后该菌对这类药物也产生耐药性。药敏试验结果提醒畜主对药物切不可滥用，以免产生耐药性，最好通过药敏试验来筛选最敏感药物进行治疗。
参考文献
[1] 黄新新，陆承平.迟缓爱德华菌的外膜蛋白图谱及耐药性分析[J].微生物学报，2001，41（5）：630-631.
[2] 陆承平.兽医微生物学[M].5版.北京：中国农业出版社，2012：11.
[3] 崔治中.鸡病[M].北京：中国农业出版社，2009：68-69.
[4] 李云章.兽医专业毕业实习指导[M].北京：中国农业出版社，2013：73-74.
[5] 翟小敏.A+OSA污泥减量工艺微生物特性研究[D].重庆：重庆大学，2012.
[6] 刘杰，赵满仓.革兰染色的实验室质量管理及进展[J].解放军医药杂志，2013，25（5）：83-86.
[7] 周忠坤.沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].现代农业，2015（9）：94-95.
[8] 毕水莲.奇异变形杆菌可移动耐药基因岛研究[D].广州：华南理工大学，2011.
[9] 龙海波.小麦禾谷孢囊线虫β-1，4-内切葡聚糖酶和细胞壁扩展蛋白基因的克隆及功能分析[D].北京：中国农业科学院，2012.