探讨蛆虫清创疗法(MDT)促进糖尿病足溃疡(DFU)患者创面血管新生的机制。
方法(1)将东部战区空军医院2018年6月—2019年6月收治的符合入选标准的12例应用MDT(疗程为3 d)的DFU患者[男6例、女6例，年龄(56±12)岁]、12例无糖尿病的急性外伤患者[男6例、女6例，年龄(53±10)岁]分别设为DFU组与外伤无糖尿病组。应用MDT前后观察DFU组患者创面大体情况并留取创面组织，留取外伤无糖尿病组患者首次就诊时清创前创面组织，采用免疫组织化学法检测DFU组患者应用MDT前后创面组织中血管新生标志物CD31的表达，分别采用蛋白质印迹法、实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测DFU组患者应用MDT前后及外伤无糖尿病组患者清创前创面组织中脂肪酸合成酶(FAS)的蛋白、mRNA表达。(2)用含体积分数10%胎牛血清的内皮细胞培养基体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，取第3～6代对数生长期细胞进行以下实验。取3 d龄无菌丝光绿蝇幼虫，提取分泌排泄物(ES)用于后续实验。取3个批次细胞，均分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、单纯高糖组、高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组和高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组，分别加入PBS、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖＋终质量浓度5 μg/mL蛆虫ES、终物质的量浓度20 mmol/L葡萄糖＋终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES处理，各组试剂总体积相同。培养48 h，分别采用蛋白质印迹法、实时荧光定量RT-PCR法和免疫荧光法检测各批次细胞中FAS的蛋白、mRNA表达情况及细胞内FAS蛋白表达与定位情况，其中mRNA表达样本数为3。(3)取2个批次细胞，均分为单纯小干扰RNA(siRNA)对照组、siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组，分别转染终物质的量浓度为100 μmol/L的无意义对照siRNA、无意义对照siRNA、siRNA-FAS 4～6 h，之后分别加入PBS、终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES、终质量浓度10 μg/mL蛆虫ES常规培养24 h，各组试剂的总体积相同。1个批次细胞进行划痕试验，划痕后24 h观察划痕宽度，检测细胞迁移能力；1个批次细胞进行成管实验，培养24 h后观察细胞小管生成情况。划痕试验和成管实验样本数均为3。对数据行t检验、单因素方差分析、LSD检验、重复测量方差分析及Bonferroni法。
结果(1)与应用MDT前比较，DFU组患者应用MDT后创面新鲜肉芽组织明显增多，坏死组织明显减少；创面组织中CD31表达明显增多。DFU组患者应用MDT前创面组织中FAS蛋白表达较外伤无糖尿病组清创前明显减少，DFU组患者应用MDT后创面组织中FAS蛋白表达较应用MDT前明显增多。DFU组患者应用MDT前创面组织中FAS mRNA表达量为1.00±0.17，较外伤无糖尿病组清创前的3.87±1.02明显减少(t＝9.808，P<0.01)；DFU组患者应用MDT后创面组织中FAS mRNA表达量为1.85±0.31，较应用MDT前明显增多(t＝-10.853，P<0.01)。(2)培养48 h，蛋白质印迹法检测显示，单纯高糖组细胞中FAS蛋白表达较PBS对照组明显减少，高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组、高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组细胞中FAS蛋白表达较单纯高糖组明显增多。实时荧光定量RT-PCR法检测显示，单纯高糖组细胞中FAS mRNA相对表达量为0.392±0.073，较PBS对照组的1.000±0.085明显减少(P<0.01)；高糖＋5 μg/mL蛆虫ES组和高糖＋10 μg/mL蛆虫ES组细胞中FAS mRNA相对表达量分别为0.561±0.047、0.687±0.013，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且均较单纯高糖组显著增多(P<0.01)。免疫荧光法检测结果显示，各组细胞内FAS蛋白主要定位在细胞质中，表达情况与蛋白质印迹法检测结果相近。(3)划痕后24 h，siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞划痕未愈合宽度明显窄于单纯siRNA对照组(P<0.01)，siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞划痕未愈合宽度明显宽于siRNA对照＋蛆虫ES组(P<0.01)。培养24 h，siRNA对照＋蛆虫ES组、siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞小管生成数明显多于单纯siRNA对照组(P<0.05或P<0.01)，siRNA-FAS＋蛆虫ES组细胞小管生成数明显少于siRNA对照＋蛆虫ES组(P<0.05)。
结论MDT通过蛆虫ES上调FAS的表达水平促进血管内皮细胞活力，从而促进DFU患者创面血管新生。