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目的
构建携带大鼠脑源性神经生长因子(BDNF)基因的重组慢病毒表达载体，并转染脂肪干细胞(ADSCs)来获得治疗的种子细胞。
方法从已构建好的含BDNF的质粒克隆模板pEGFP-C-BDNF中，利用聚合酶链反应(PCR)方法提取目的基因BDNF，将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒GV287(含Flag基因)中，得到重组的UBI-BDNF，通过PCR、酶切、测序和分析比对验证BDNF基因后，将UBI-BDNF质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞，经同源重组产生重组慢病毒UBI-BDNF。UBI-BDNF在293T细胞内大量扩增，应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法鉴定和测定滴度，然后转染ADSCs，并通过免疫荧光法及酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot)检测。
结果克隆得到791 bp的目的BDNF全长基因，经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实，BDNF基因被成功克隆到慢病毒载体中，可实现BDNF基因的表达，且病毒滴度为2.0×109 TU/ml。免疫荧光检测BDNF在转染ADSCs中表达。ELISA检测转染ADSCs上清液中BDNF浓度为891.38～1 196.26 ng/L[(945.33±38.54) ng/L]，而绿色荧光蛋白(GFP)转染ADSCs中未检测到。Western blot证实转染ADSCs表达BDNF蛋白。
结论成功构建表达大鼠BDNF基因的慢病毒载体并能在ADSCs高表达。