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[摘要] 目的 探讨UCA1 mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达及其与病理分级、临床分期和复发的关系。方法 采用SYBR GreenⅡ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试验方法检测39例膀胱癌组织及8例膀胱正常组织中UCA1 mRNA的表达情况。结果 39例膀胱癌组织中UCA1 mRNA表达阳性39例,阳性率分别为100%;8例膀胱正常组织中UCA1 mRNA表达阳性3例,阳性率分别为37.5%;UCA1 mRNA的表达在癌组织和正常组织中的阳性率比较差异有显著性(P<0.05);UCA 1mRNA的表达与病理分级、临床分期和复发关系密切(P<0.05)。结论 UCA1参与了膀胱癌的发生发展过程,对膀胱癌的诊断、判断病理分级、临床分期和预后具有重要临床意义。
[关键词] UCA1;膀胱癌;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应;SYBR GreenⅡ
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-16-03
UCA1 Expression in Bladder Cancer and Its Clinical Significance
WANG BaosenXING JinchunZHENG Jiaxin
Department of Urology,the Affiliated Xiamen First Hospital of Fujian Medical University,Xiamen 361003,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of UCA1 mRNA in bladder transitional cell carcinoma and its relationship with pathological grade,clinical stage and recurrence. Methods The SYBR Green II real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to evaluate the UCA1 mRNA expression in 39 cases of bladder transitional cell carcinoma and 8 cases of normal tissue. Results All of 39 cases of bladder transitional cell carcinoma cases showed the positive expression of UCA1 mRNA,with the positive rate of 100%,and 3 of 8 cases of normal tissue showed the positive expression of UCA1 mRNA,with the positive rate of 37.5%. There was a significant difference in the positive rate of between the two(P<0.05). There was a close relation between the pathological grade(P<0.05), the clinical stage(P<0.05)and recurrence(P<0.05). Conclusion UCA1 is involved in the development and progression of bladder transitional cell carcinoma and it is of important clinical significance in the diagnosis of bladder transitional cell carcinoma and the judgement of pathological grade,clinical stage and prognosis.
[Key words] UCA1;Bladder cancer;Real time quantitative RT-PCR;SYBR Green Ⅱ
UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是最近发现的一个新的膀胱癌的特异性非编码基因,本文运用SYBR GreenⅡ实时荧光定量RT-PCR的方法检测39例膀胱癌组织及9例膀胱正常组织中UCA1 mRNA,探讨其表达与膀胱癌临床分期和病理分级的关系,进一步为膀胱的诊断、治疗和预后提供临床依据。
1材料与方法
1.1标本来源
选取我院2008年10月～2009年9月术后病理证实为膀胱癌的膀胱癌标本39份,其中膀胱肿瘤电切的标本31份,行全膀胱手术的肿瘤标本8份,初发28例,复发11例。所有膀胱癌患者中男32例,女7例。年龄(60.72±13.19)岁。根据肿瘤浸润深度可分为表浅型(Tis、Ta、T1)和浸润型,其中表浅型26例,浸润型13例。病理情况根据WHO/ISUP分级法,其中高级别尿路上皮癌9例,低级别尿路上皮癌(包括低度恶性倾向尿路上皮乳头瘤)30例;膀胱正常组织8份,其中1份前列腺增生患者正常膀胱组织,其余7份为膀胱肿瘤边缘3cm以外的正常膀胱组织,其中男6份,女2份,年龄(63.75±12.45)岁。所有标本在手术切除后立即取材放入RNA保存液然后保存于-70oC低温冰箱中保存。
1.2试剂和仪器
总RNA提取试剂盒(离心柱型)(TIANGEN,厦门泰京生物技术公司),PrimeScript TMRT reagent kit and SYBR○R Premix Ex Taq TMII(TaKaRa,大连宝生物工程有限公司),低温离心机(德国SIGMA公司)、UV-2450分光分度仪(日本岛津公司)、Bio-Rad Thermal Cycler(美国伯乐公司)、Roche Light Cycler480 荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)等。
1.3方法
1.3.1总RNA的提取及浓度测定使用离心柱型总RNA 提取试剂盒,得到35μL 总RNA,然后取5μL稀释20倍后用UV-2450分光分度仪进行纯度(OD260/OD280)和浓度[(OD260 -0.024)*20]测定。
1.3.2逆转录cDNA使用 PrimeScript TMRT reagent kit试剂盒,10μL反应体系包括6xPrimeScript TM buffer 2μL,Random 6mers(100uM)0.5μL、PrimeScript TMRT Enzyme 0.5μL、Oligo dT primer 0.5μL、加入总RNA 500ng/(RNA浓度),加RNase Free dH2O至10μL,反应条件37oC 15min,85℃ 5sec, 最后降至4℃,逆转录完成后加dH2O 40μL将其稀释5倍-20℃保存。
1.3.3实时PCR运用NCBI Primer Design Tool 设计引物,UCA1 Forward primer GCTTAGGCTGGCAACCATCA,Reverse primer AAGCTGAGGCTGGCAAAGAG;GAPDH Forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,Reverse primer GAAGATGGTGGG ATTTC,分别扩增190bp和226bp片段长度,引物送Ivitrogen公司合成。运用SYBR GREEN II real time PCR 法,反应条件:10μL反应体系中含有SYBR○RPremix Ex TaqTM Ⅱ 5μL,PCR Forward Primer和 PCR Reverse Primer 各0.4μL,dH2O 3.2μL,DNA 模板1μL,扩增条件95℃ 5sec,60℃ 15sec, 72℃ 15sec,共45个循环。熔解曲线条件95℃ 5sec、4.4℃/s, 65℃ 1min、2.2℃/s。
1.4结果判定
Roche Light Cycler480荧光定量PCR仪检测结果由Light Cycler软件系统进行分析,相对定量采用比较Cp值法,即以目的基因UCA1 mRNA Cp值和内参基因GAPDH mRNA Cp值的比值R作为评价表达水平的标准,通过分析熔解曲线来判断PCR产物特异性,扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波的形状锐利,说明反应特异性好。
1.5统计学分析
数据分析使用SPSS 13.0统计软件,两组间阳性率的比较用χ2检验;偏态分布的数据采用中位数(M)及四分位间距(QR),组间比较采用Mann-Whitney U检验;P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1FQ-RT-PCR检测结果
见图1。S型曲线表示有mRNA扩增,阴性对照及阳性对照在45个循环结束时均未出现S型曲线属正常结果,其扩增产物的特异性通过熔解曲线判定见图2。UCA1和内参GAPDH两对引物在同一体系中均扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波峰形状锐利,说明反应特异性好。8例膀胱正常组织中UCA1 mRNA阳性表达3例,阳性率37.5%;39例膀胱癌组织中UCA1 mRNA阳性率100%,正常组织和癌组织UCA1 mRNA阳性率比较用χ2检验,χ2=21.10,P<0.05,两者比较有显著性差异,说明UCA1可作为膀胱癌诊断的检测指标,对膀胱癌的诊断具有重要的意义。
2.2UCA1 mRNA在39例不同分级、分期及初发和复发膀胱癌组织的表达情况
见表1。结果显示,其在不同病理分级、分期及其在初发和复发癌组织的表达均有统计学意义,UCA1对膀胱癌进展程度判断的具有重要意义,其可能通过某种机制对膀胱癌的复发有关。
3讨论
膀胱癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在泌尿系肿瘤中位居第1位[1],其主要的病理类型是膀胱移行细胞癌,约占90%以上,其发生、发展是多基因共同作用的结果。目前对于膀胱癌的诊断除了CT和MRI以及膀胱镜检查外尚缺乏一个理想的分子标志物,但是CT和MRI的诊断率较低,而膀胱镜检查敏感性低且为有创检查,易增加尿路感染的机会,其特异性也易受标本收集和尿路感染等影响。在大多数情况下以浅表性膀胱移行细胞癌出现,虽然它可以很容易的通过膀胱肿瘤电切手术切除,但膀胱癌具有复发率较高的特点,且复发后肿瘤恶性度增高,浸润和转移等恶性行为有所增强。据文献报道5年复发率超过60%,15年的复发率超过80%,而在这些复发的膀胱癌患者中,约10%～30%进展为浸润性膀胱癌[2-3]。目前虽然有许多潜在的生物标记物可以用来判断膀胱癌的进展和预后,但是迄今没有一个可靠的分子标记物可以用来检测膀胱癌的发生发展和复发以降低病人的死亡率[4]。
近年来,许多研究突出强调了长片段(400bp)非编码RNA在肿瘤形成过程中起重要作用,暗示其可以被用来作为肿瘤标志物[5-6]。目前关于非编码RNA在膀胱肿瘤中研究却相对较少,王凡等[7]运用抑制性杂交消减技术从膀胱移行细胞癌细胞株BLZ -211和BLS-211中分离出一个新的表达序列表签(基因序列号DR159656),UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是基于该已表达序列表签从BLZ-211细胞基因序列中克隆鉴别出的一个非编码RNA,亦为一个膀胱癌特异性基因,通常高表达于胚胎组织、大多数胎儿组织和膀胱癌组织中,但在胎儿出生后,UCA1表达开始逐渐降低至消失,在成人仅高表达于膀胱癌组织,UCA1这种基因表达形式的时间性和空间性类似于ncRNA H19[8],暗示它是一个癌胚基因;在BLS-211细胞株的研究中,UCA1基因的外源性表达提示它具有致瘤性、侵袭潜能并与药物耐药性有关,在膀胱癌的浸润和进展过程中起一定的作用。UCA1具有较好的稳定性,并且很少受到肿瘤遗传异质性的影响,在正常组织、泌尿系其他疾病如前列腺增生症、腺性膀胱炎等和其他类型肿瘤尤其是肾脏肿瘤中均低表达,使其在膀胱移行细胞癌患者与正常人和其他的泌尿系肿瘤的鉴别中具有重要意义[9]。本研究通过应用实时荧光定量PCR技术检测UCA1 mRNA 在膀胱癌患者癌组织和正常组织中表达情况,证实UCA1 mRNA在膀胱癌组织中高表达,阳性率高达100%,在正常膀胱组织中低表达,阳性率37.5%,两者比较差异有统计学意义,其表达含量在不同临床分期、临床分级、初次和复发之间比较差异均有统计学意义,用定量的方法进一步证实UCA1在膀胱癌的诊断以及判断进展和预后情况方面具有重要意义,可为临床治疗提供重要依据。
至今UCA1在胚胎形成中的作用以及在膀胱癌发生发展和复发过程中的作用机制尚不明确,它在膀胱癌治疗方面能否成为基因靶向治疗的一个新的靶点,有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Zhang W,Xiang YB,Liu ZW,et al. Trends analysis of common urologic neoplasm incidence of elderly people in Shanghai[J]. Ai Zheng,1999,23:555-558.
[2] Kamat AM, Lamm DL. Chemoprevention of urologic cancer[J]. JUrol,1999,161:1748-1760.
[3] Sugano K,Kakizoe T. Genetic alterations in bladder cancer and their clinical applications in molecular tumor staging[J]. NatClinPract Urol,2006,3:642-652.
[4] Barocas DA,Clark PE. Bladder cancer[J]. Curr Opin Oncol,2008,20:307-314.
[5] Panzitt K,Tschernatsch MM,Guelly C,et al. Characterization of HULC,a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma,as noncoding RNA[J]. Gastroenterology,2007,132:330-342.
[6] Petrovics G,Zhang W,Makarem M,et al. Elevated expression of PCGEM1,a prostate specific gene with cell growth-promoting function, is associated with high-risk prostate cancer patients[J]. Oncogene,2004,23:605-611.
[7] F Wang, Li X, Xie XJ, etal. UCA1,a non-protein-coding RNA up-regulated in bladder carcinoma and embryo,influencing cell growth and promoting invasion[J]. FEBS Letters, 2008, 582:1919- 1927.
[8] LooijengaLH,Verkerk AJ,De Groot N,et al. H19 in normal development and neoplasia[J]. Mol ReprodDev,1997,46:419-439.
[9] Wang XS,Zhang Z,Wang HC,et al. Rapid Identification of UCA1 as a very sensitive and specific unique marker for human bladder carcinoma[J]. Clin Cancer Res,2006,12(16):4851-4858.
(收稿日期:2009-11-02)
[关键词] UCA1;膀胱癌;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应;SYBR GreenⅡ
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-16-03
UCA1 Expression in Bladder Cancer and Its Clinical Significance
WANG BaosenXING JinchunZHENG Jiaxin
Department of Urology,the Affiliated Xiamen First Hospital of Fujian Medical University,Xiamen 361003,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of UCA1 mRNA in bladder transitional cell carcinoma and its relationship with pathological grade,clinical stage and recurrence. Methods The SYBR Green II real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to evaluate the UCA1 mRNA expression in 39 cases of bladder transitional cell carcinoma and 8 cases of normal tissue. Results All of 39 cases of bladder transitional cell carcinoma cases showed the positive expression of UCA1 mRNA,with the positive rate of 100%,and 3 of 8 cases of normal tissue showed the positive expression of UCA1 mRNA,with the positive rate of 37.5%. There was a significant difference in the positive rate of between the two(P<0.05). There was a close relation between the pathological grade(P<0.05), the clinical stage(P<0.05)and recurrence(P<0.05). Conclusion UCA1 is involved in the development and progression of bladder transitional cell carcinoma and it is of important clinical significance in the diagnosis of bladder transitional cell carcinoma and the judgement of pathological grade,clinical stage and prognosis.
[Key words] UCA1;Bladder cancer;Real time quantitative RT-PCR;SYBR Green Ⅱ
UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是最近发现的一个新的膀胱癌的特异性非编码基因,本文运用SYBR GreenⅡ实时荧光定量RT-PCR的方法检测39例膀胱癌组织及9例膀胱正常组织中UCA1 mRNA,探讨其表达与膀胱癌临床分期和病理分级的关系,进一步为膀胱的诊断、治疗和预后提供临床依据。
1材料与方法
1.1标本来源
选取我院2008年10月～2009年9月术后病理证实为膀胱癌的膀胱癌标本39份,其中膀胱肿瘤电切的标本31份,行全膀胱手术的肿瘤标本8份,初发28例,复发11例。所有膀胱癌患者中男32例,女7例。年龄(60.72±13.19)岁。根据肿瘤浸润深度可分为表浅型(Tis、Ta、T1)和浸润型,其中表浅型26例,浸润型13例。病理情况根据WHO/ISUP分级法,其中高级别尿路上皮癌9例,低级别尿路上皮癌(包括低度恶性倾向尿路上皮乳头瘤)30例;膀胱正常组织8份,其中1份前列腺增生患者正常膀胱组织,其余7份为膀胱肿瘤边缘3cm以外的正常膀胱组织,其中男6份,女2份,年龄(63.75±12.45)岁。所有标本在手术切除后立即取材放入RNA保存液然后保存于-70oC低温冰箱中保存。
1.2试剂和仪器
总RNA提取试剂盒(离心柱型)(TIANGEN,厦门泰京生物技术公司),PrimeScript TMRT reagent kit and SYBR○R Premix Ex Taq TMII(TaKaRa,大连宝生物工程有限公司),低温离心机(德国SIGMA公司)、UV-2450分光分度仪(日本岛津公司)、Bio-Rad Thermal Cycler(美国伯乐公司)、Roche Light Cycler480 荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)等。
1.3方法
1.3.1总RNA的提取及浓度测定使用离心柱型总RNA 提取试剂盒,得到35μL 总RNA,然后取5μL稀释20倍后用UV-2450分光分度仪进行纯度(OD260/OD280)和浓度[(OD260 -0.024)*20]测定。
1.3.2逆转录cDNA使用 PrimeScript TMRT reagent kit试剂盒,10μL反应体系包括6xPrimeScript TM buffer 2μL,Random 6mers(100uM)0.5μL、PrimeScript TMRT Enzyme 0.5μL、Oligo dT primer 0.5μL、加入总RNA 500ng/(RNA浓度),加RNase Free dH2O至10μL,反应条件37oC 15min,85℃ 5sec, 最后降至4℃,逆转录完成后加dH2O 40μL将其稀释5倍-20℃保存。
1.3.3实时PCR运用NCBI Primer Design Tool 设计引物,UCA1 Forward primer GCTTAGGCTGGCAACCATCA,Reverse primer AAGCTGAGGCTGGCAAAGAG;GAPDH Forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC,Reverse primer GAAGATGGTGGG ATTTC,分别扩增190bp和226bp片段长度,引物送Ivitrogen公司合成。运用SYBR GREEN II real time PCR 法,反应条件:10μL反应体系中含有SYBR○RPremix Ex TaqTM Ⅱ 5μL,PCR Forward Primer和 PCR Reverse Primer 各0.4μL,dH2O 3.2μL,DNA 模板1μL,扩增条件95℃ 5sec,60℃ 15sec, 72℃ 15sec,共45个循环。熔解曲线条件95℃ 5sec、4.4℃/s, 65℃ 1min、2.2℃/s。
1.4结果判定
Roche Light Cycler480荧光定量PCR仪检测结果由Light Cycler软件系统进行分析,相对定量采用比较Cp值法,即以目的基因UCA1 mRNA Cp值和内参基因GAPDH mRNA Cp值的比值R作为评价表达水平的标准,通过分析熔解曲线来判断PCR产物特异性,扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波的形状锐利,说明反应特异性好。
1.5统计学分析
数据分析使用SPSS 13.0统计软件,两组间阳性率的比较用χ2检验;偏态分布的数据采用中位数(M)及四分位间距(QR),组间比较采用Mann-Whitney U检验;P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1FQ-RT-PCR检测结果
见图1。S型曲线表示有mRNA扩增,阴性对照及阳性对照在45个循环结束时均未出现S型曲线属正常结果,其扩增产物的特异性通过熔解曲线判定见图2。UCA1和内参GAPDH两对引物在同一体系中均扩增出了单一产物,未出现其他异常波形,波峰形状锐利,说明反应特异性好。8例膀胱正常组织中UCA1 mRNA阳性表达3例,阳性率37.5%;39例膀胱癌组织中UCA1 mRNA阳性率100%,正常组织和癌组织UCA1 mRNA阳性率比较用χ2检验,χ2=21.10,P<0.05,两者比较有显著性差异,说明UCA1可作为膀胱癌诊断的检测指标,对膀胱癌的诊断具有重要的意义。
2.2UCA1 mRNA在39例不同分级、分期及初发和复发膀胱癌组织的表达情况
见表1。结果显示,其在不同病理分级、分期及其在初发和复发癌组织的表达均有统计学意义,UCA1对膀胱癌进展程度判断的具有重要意义,其可能通过某种机制对膀胱癌的复发有关。
3讨论
膀胱癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在泌尿系肿瘤中位居第1位[1],其主要的病理类型是膀胱移行细胞癌,约占90%以上,其发生、发展是多基因共同作用的结果。目前对于膀胱癌的诊断除了CT和MRI以及膀胱镜检查外尚缺乏一个理想的分子标志物,但是CT和MRI的诊断率较低,而膀胱镜检查敏感性低且为有创检查,易增加尿路感染的机会,其特异性也易受标本收集和尿路感染等影响。在大多数情况下以浅表性膀胱移行细胞癌出现,虽然它可以很容易的通过膀胱肿瘤电切手术切除,但膀胱癌具有复发率较高的特点,且复发后肿瘤恶性度增高,浸润和转移等恶性行为有所增强。据文献报道5年复发率超过60%,15年的复发率超过80%,而在这些复发的膀胱癌患者中,约10%～30%进展为浸润性膀胱癌[2-3]。目前虽然有许多潜在的生物标记物可以用来判断膀胱癌的进展和预后,但是迄今没有一个可靠的分子标记物可以用来检测膀胱癌的发生发展和复发以降低病人的死亡率[4]。
近年来,许多研究突出强调了长片段(400bp)非编码RNA在肿瘤形成过程中起重要作用,暗示其可以被用来作为肿瘤标志物[5-6]。目前关于非编码RNA在膀胱肿瘤中研究却相对较少,王凡等[7]运用抑制性杂交消减技术从膀胱移行细胞癌细胞株BLZ -211和BLS-211中分离出一个新的表达序列表签(基因序列号DR159656),UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是基于该已表达序列表签从BLZ-211细胞基因序列中克隆鉴别出的一个非编码RNA,亦为一个膀胱癌特异性基因,通常高表达于胚胎组织、大多数胎儿组织和膀胱癌组织中,但在胎儿出生后,UCA1表达开始逐渐降低至消失,在成人仅高表达于膀胱癌组织,UCA1这种基因表达形式的时间性和空间性类似于ncRNA H19[8],暗示它是一个癌胚基因;在BLS-211细胞株的研究中,UCA1基因的外源性表达提示它具有致瘤性、侵袭潜能并与药物耐药性有关,在膀胱癌的浸润和进展过程中起一定的作用。UCA1具有较好的稳定性,并且很少受到肿瘤遗传异质性的影响,在正常组织、泌尿系其他疾病如前列腺增生症、腺性膀胱炎等和其他类型肿瘤尤其是肾脏肿瘤中均低表达,使其在膀胱移行细胞癌患者与正常人和其他的泌尿系肿瘤的鉴别中具有重要意义[9]。本研究通过应用实时荧光定量PCR技术检测UCA1 mRNA 在膀胱癌患者癌组织和正常组织中表达情况,证实UCA1 mRNA在膀胱癌组织中高表达,阳性率高达100%,在正常膀胱组织中低表达,阳性率37.5%,两者比较差异有统计学意义,其表达含量在不同临床分期、临床分级、初次和复发之间比较差异均有统计学意义,用定量的方法进一步证实UCA1在膀胱癌的诊断以及判断进展和预后情况方面具有重要意义,可为临床治疗提供重要依据。
至今UCA1在胚胎形成中的作用以及在膀胱癌发生发展和复发过程中的作用机制尚不明确,它在膀胱癌治疗方面能否成为基因靶向治疗的一个新的靶点,有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Zhang W,Xiang YB,Liu ZW,et al. Trends analysis of common urologic neoplasm incidence of elderly people in Shanghai[J]. Ai Zheng,1999,23:555-558.
[2] Kamat AM, Lamm DL. Chemoprevention of urologic cancer[J]. JUrol,1999,161:1748-1760.
[3] Sugano K,Kakizoe T. Genetic alterations in bladder cancer and their clinical applications in molecular tumor staging[J]. NatClinPract Urol,2006,3:642-652.
[4] Barocas DA,Clark PE. Bladder cancer[J]. Curr Opin Oncol,2008,20:307-314.
[5] Panzitt K,Tschernatsch MM,Guelly C,et al. Characterization of HULC,a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma,as noncoding RNA[J]. Gastroenterology,2007,132:330-342.
[6] Petrovics G,Zhang W,Makarem M,et al. Elevated expression of PCGEM1,a prostate specific gene with cell growth-promoting function, is associated with high-risk prostate cancer patients[J]. Oncogene,2004,23:605-611.
[7] F Wang, Li X, Xie XJ, etal. UCA1,a non-protein-coding RNA up-regulated in bladder carcinoma and embryo,influencing cell growth and promoting invasion[J]. FEBS Letters, 2008, 582:1919- 1927.
[8] LooijengaLH,Verkerk AJ,De Groot N,et al. H19 in normal development and neoplasia[J]. Mol ReprodDev,1997,46:419-439.
[9] Wang XS,Zhang Z,Wang HC,et al. Rapid Identification of UCA1 as a very sensitive and specific unique marker for human bladder carcinoma[J]. Clin Cancer Res,2006,12(16):4851-4858.
(收稿日期:2009-11-02)