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摘要 [目的]对水稻叶色发育缺陷突变体的研究有助于阐释高等植物叶绿体发育和光合作用所必需的基因网络。[方法]从籼稻品种华粳籼74发展的一个株系中出现幼苗期叶片白化、四叶期枯死的表型分离，通过与粳稻中花11构建F2群体和分子标记，对突变体进行遗传分析和基因定位。[结果]该白化突变体由一对隐性核基因控制，暂命名为alb24，定位于第6染色体SSR标记RM276和Indel标记ID49551之间，遗传距离分别为5.0和0.1 cM。[结论] ALB24基因的初步定位为进一步的精细定位和克隆该基因奠定了基础。
关键词 水稻；白化突变体；遗传分析；基因定位
中图分类号 S511 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）17-05377-03
Abstract [Objective] To study on defective mutants of rice leaf development helps explain chloroplast development and gene networks required for photosynthesis in higher plants. [Method] A mutant line developed from an indica variety Huajingxian74 showed segragation of albino leaves in seedling stage and lethality in fourleaf stage. Genetic analysis and gene mapping of the mutant was conducted through the development of molecular markers and F2 population derived from the cross between a japonica variety Zhonghua 11 and the mutant. [Result] The genetic analysis showed that the albino phenotype was controlled by a single recessive gene， named as alb24， and ALB24 was mapped between SSR maker RM276 and InDel maker ID49551 on chromosome 6， with genetic distances of 5.0 and 0.1 cM， respectively. [Conclusion] The results of primary mapping of ALB24 laid the foundation for further fine mapping and cloning of the gene.
Key words Rice （Orzya sativa L.）； Albino mutant； Genetic analysis； Gene mapping
叶色变异是植物较常见的一种表型变异，是研究植物光合作用、光形态建成、激素生理以及抗病机制等一系列生理代谢过程的好材料[1]。由于导致突变的基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体。叶色突变依据突变表型出现的时期，可分为苗期叶色突变和苗期后叶色突变。一般来讲，苗期叶色突变大多在幼苗期已可见突变性状，且变异类型丰富，有黄化、白化和淡绿色等多种变异类型。
目前，国内外已经报道了80多个水稻苗期叶绿素突变有关基因，部分基因已被克隆，主要涉及与叶绿素合成和降解相关的基因[2]。此外，多个研究表明与光合系统无直接关系的基因突变也会造成苗期叶色突变[3-5]。
水稻作为模式植物，水稻白化突变体是研究植物叶绿素合成、叶绿体分化以及质-核互作的理想材料。实验室获得一个水稻白化突变体alb24。笔者在遗传分析的基础上，对控制该白化突变性状的基因进行定位，以期为该基因的克隆奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 水稻白化突变体在华粳籼74的后代中篩选获得，再经自交和选择，成为遗传稳定的品系。中花11为发育正常的粳稻品种。
1.2 遗传分析和定位群体的构建 利用水稻白化苗突变体与中花11配置杂交组合，F1自交获得F2。F2群体用于水稻白化苗性状的遗传分析及相关基因的分子定位。
1.3 基因定位的方法 采用TPS法提取水稻叶片DNA[6]。定位中连锁标记的筛选采用Michelmore 等[7]提出的近等基因池分析法。将F2分离群体中的正常株和白化苗分成2组，每组内将20个单株的DNA混合，形成正常株和突变体的2个池。利用
SSR分子标记技术寻找在2个池的扩增有差异的谱带；再用分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离。利用shen等[8]发展的水稻全基因组DNA多态数据库在目标区域发展InDel 标记；根据分子标记分析的结果，利用MAPMAKER （EXP3.0b）作图软件[9]，构建目标基因区域的分子标记连锁图谱。
2 结果与分析
2.1 突变体的表型特征和遗传分析 突变体alb24出苗即白化，3 d后白化特征更清晰。待幼苗长至3片叶时，第1叶淡绿色，部分植株第3叶叶尖沿叶缘出现转绿迹象。3叶期后（第11天），白化苗叶尖开始枯黄，直至4叶期枯死。
将华粳籼74与中花11配置正反交杂交组合，其F1均表现为正常绿色，说明该白化性状为隐性遗传，绿色对白化为显性。F1代自交，获得7个F2分离群体。对各群体的叶色性状进行观察（表1），在同一世代分离群体中不同株系的植株均出现绿苗和白化苗2种表型，经χ2验证，其分离比符合3 ∶1的分离比例，说明该白化性状是受1对隐性核基因控制。 2.3 候选基因分析 由基因定位结果可知，目的基因ALB24距最近的标记ID4955-1的遗传距离为0.1 cM，而该遗传距离约相当于物理距离30 kb。为此，试验利用水稻基因组注释数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）重点对靠近标记ID4955-1的定位区间进行分析，发现LOC_Os06g13000基因编码一个锚蛋白（ankyrin repeat domain-containing protein），可能與叶绿体发育有关。
3 结论与讨论
白化（albino） 是植物叶色突变体的常见类型之一，其表型的产生与叶绿素合成密切相关，受遗传因素和外部环境的共同作用。目前，定位在第6染色体上的白化突变体基因有albino1[10]和albino9[11]，但这2个基因的染色体区间尚不知。ALB24定位在RM276与ID49551之间5.0 cM的范围内，尚不知ALB24是否与albino1或albino9基因等位。
试验将ALB24基因定位在水稻第6染色体SSR标记RM276和InDel标记ID4955-1之间，分别距其5.0和0.1 cM，利用水稻基因组注释数据库对该区域序列进行分析，其间存在1个与叶绿素缺失相关的基因LOC_Os06g13000。LOC_Os06g13000基因与拟南芥EMB506 （AT5G40160）同源。在拟南芥中EMB506是胚胎发育所必需的，且影响叶绿体发育。但要最终确定LOC_Os06g13000基因是否为alb24突变体的候选基因，还有待进一步的验证。
水稻白化突变体alb24属隐性突变，由一对核基因控制。突变体候选基因ALB24位于水稻第6染色体的SSR标记RM276和Indel标记ID49551之间，遗传距离分别为5.0和0.1 cM。ALB24基因的初步定位为进一步的精细定位和克隆该基因奠定了基础。
参考文献
[1]FAMBRINI M，CASTAGNA A，VECCHIA F D，et al.Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower （Haveelianthus annuus L.） with abnormal chloroplast biogenesis，reduced PSII activity and low endogenous level of abscisic acid[J].Plant Science，2004，167（1）：79-89.
[2] 魏彦林，施勇烽，吴建利.水稻核基因控制的叶色变异[J].核农学报，2011，25（6）：1169-1178.
[3] SUGIMOTO H，KUSUMI K，NOGUCHI K，et al.The rice nuclear gene，virescent 2，is essential for chloroplast development and encodes a novel type of guanylate kinase targeted to plastids and mitochondria[J].The Plant Journal，2007，52（3）：512-527.
[4] LI J，PANDEYA D，NATH K，et al.Zebra-necrosis，a thylakoid-bound protein，is critical for the photoprotection of developing chloroplasts during early leaf development[J].The Plant Journal，2010，62（4）：713-725.
[5] GOTHANDAM K M，KIM E，CHO H，et al.Osppr1，a pentatricopeptide repeat protein of rice is essential for the chloroplast biogenesis[J].Plant Molecular Biology，2005，58（3）：421-433.
[6] 张向前，邹金松，朱海涛，等.水稻早熟多子房突变体fon5的遗传分析和基因定位[J].遗传，2008，30（10）：1349-1355.
[7] MICHELMORE R W，PARAN I，KESSELI R V.Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysis：a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88（21）：9828-9832.
[8] SHEN Y，JIANG H，JIN J，et al.Development of genome-wide dna polymorphism database for map-based cloning of rice genes[J].Plant Physiology，2004，135（3）：1198-1205.
[9] LANDER E S，GREEN P，ABRAHAMSON J，et al.Mapmaker：an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations[J].Genomics，1987，1（2）：174-181.
[10] IWATA N，OMURA T.Linkage studies in rice （Oryza sativa L.） some albino genes and their linkage relation with marker genes[J].Sci Bull Fac Agr Kyushu Univ，1978，33：11-18.
[11] IWATA N，SATOH H，OMURA T.Linkage analysis by use of trisomics in rice （Oryza sativa L.） IV. Linkage groups locating on chromosomes 2 and 10[J].Japan J Breed，1981，31（1）：66-67.
关键词 水稻；白化突变体；遗传分析；基因定位
中图分类号 S511 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）17-05377-03
Abstract [Objective] To study on defective mutants of rice leaf development helps explain chloroplast development and gene networks required for photosynthesis in higher plants. [Method] A mutant line developed from an indica variety Huajingxian74 showed segragation of albino leaves in seedling stage and lethality in fourleaf stage. Genetic analysis and gene mapping of the mutant was conducted through the development of molecular markers and F2 population derived from the cross between a japonica variety Zhonghua 11 and the mutant. [Result] The genetic analysis showed that the albino phenotype was controlled by a single recessive gene， named as alb24， and ALB24 was mapped between SSR maker RM276 and InDel maker ID49551 on chromosome 6， with genetic distances of 5.0 and 0.1 cM， respectively. [Conclusion] The results of primary mapping of ALB24 laid the foundation for further fine mapping and cloning of the gene.
Key words Rice （Orzya sativa L.）； Albino mutant； Genetic analysis； Gene mapping
叶色变异是植物较常见的一种表型变异，是研究植物光合作用、光形态建成、激素生理以及抗病机制等一系列生理代谢过程的好材料[1]。由于导致突变的基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体。叶色突变依据突变表型出现的时期，可分为苗期叶色突变和苗期后叶色突变。一般来讲，苗期叶色突变大多在幼苗期已可见突变性状，且变异类型丰富，有黄化、白化和淡绿色等多种变异类型。
目前，国内外已经报道了80多个水稻苗期叶绿素突变有关基因，部分基因已被克隆，主要涉及与叶绿素合成和降解相关的基因[2]。此外，多个研究表明与光合系统无直接关系的基因突变也会造成苗期叶色突变[3-5]。
水稻作为模式植物，水稻白化突变体是研究植物叶绿素合成、叶绿体分化以及质-核互作的理想材料。实验室获得一个水稻白化突变体alb24。笔者在遗传分析的基础上，对控制该白化突变性状的基因进行定位，以期为该基因的克隆奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 水稻白化突变体在华粳籼74的后代中篩选获得，再经自交和选择，成为遗传稳定的品系。中花11为发育正常的粳稻品种。
1.2 遗传分析和定位群体的构建 利用水稻白化苗突变体与中花11配置杂交组合，F1自交获得F2。F2群体用于水稻白化苗性状的遗传分析及相关基因的分子定位。
1.3 基因定位的方法 采用TPS法提取水稻叶片DNA[6]。定位中连锁标记的筛选采用Michelmore 等[7]提出的近等基因池分析法。将F2分离群体中的正常株和白化苗分成2组，每组内将20个单株的DNA混合，形成正常株和突变体的2个池。利用
SSR分子标记技术寻找在2个池的扩增有差异的谱带；再用分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离。利用shen等[8]发展的水稻全基因组DNA多态数据库在目标区域发展InDel 标记；根据分子标记分析的结果，利用MAPMAKER （EXP3.0b）作图软件[9]，构建目标基因区域的分子标记连锁图谱。
2 结果与分析
2.1 突变体的表型特征和遗传分析 突变体alb24出苗即白化，3 d后白化特征更清晰。待幼苗长至3片叶时，第1叶淡绿色，部分植株第3叶叶尖沿叶缘出现转绿迹象。3叶期后（第11天），白化苗叶尖开始枯黄，直至4叶期枯死。
将华粳籼74与中花11配置正反交杂交组合，其F1均表现为正常绿色，说明该白化性状为隐性遗传，绿色对白化为显性。F1代自交，获得7个F2分离群体。对各群体的叶色性状进行观察（表1），在同一世代分离群体中不同株系的植株均出现绿苗和白化苗2种表型，经χ2验证，其分离比符合3 ∶1的分离比例，说明该白化性状是受1对隐性核基因控制。 2.3 候选基因分析 由基因定位结果可知，目的基因ALB24距最近的标记ID4955-1的遗传距离为0.1 cM，而该遗传距离约相当于物理距离30 kb。为此，试验利用水稻基因组注释数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）重点对靠近标记ID4955-1的定位区间进行分析，发现LOC_Os06g13000基因编码一个锚蛋白（ankyrin repeat domain-containing protein），可能與叶绿体发育有关。
3 结论与讨论
白化（albino） 是植物叶色突变体的常见类型之一，其表型的产生与叶绿素合成密切相关，受遗传因素和外部环境的共同作用。目前，定位在第6染色体上的白化突变体基因有albino1[10]和albino9[11]，但这2个基因的染色体区间尚不知。ALB24定位在RM276与ID49551之间5.0 cM的范围内，尚不知ALB24是否与albino1或albino9基因等位。
试验将ALB24基因定位在水稻第6染色体SSR标记RM276和InDel标记ID4955-1之间，分别距其5.0和0.1 cM，利用水稻基因组注释数据库对该区域序列进行分析，其间存在1个与叶绿素缺失相关的基因LOC_Os06g13000。LOC_Os06g13000基因与拟南芥EMB506 （AT5G40160）同源。在拟南芥中EMB506是胚胎发育所必需的，且影响叶绿体发育。但要最终确定LOC_Os06g13000基因是否为alb24突变体的候选基因，还有待进一步的验证。
水稻白化突变体alb24属隐性突变，由一对核基因控制。突变体候选基因ALB24位于水稻第6染色体的SSR标记RM276和Indel标记ID49551之间，遗传距离分别为5.0和0.1 cM。ALB24基因的初步定位为进一步的精细定位和克隆该基因奠定了基础。
参考文献
[1]FAMBRINI M，CASTAGNA A，VECCHIA F D，et al.Characterization of a pigment-deficient mutant of sunflower （Haveelianthus annuus L.） with abnormal chloroplast biogenesis，reduced PSII activity and low endogenous level of abscisic acid[J].Plant Science，2004，167（1）：79-89.
[2] 魏彦林，施勇烽，吴建利.水稻核基因控制的叶色变异[J].核农学报，2011，25（6）：1169-1178.
[3] SUGIMOTO H，KUSUMI K，NOGUCHI K，et al.The rice nuclear gene，virescent 2，is essential for chloroplast development and encodes a novel type of guanylate kinase targeted to plastids and mitochondria[J].The Plant Journal，2007，52（3）：512-527.
[4] LI J，PANDEYA D，NATH K，et al.Zebra-necrosis，a thylakoid-bound protein，is critical for the photoprotection of developing chloroplasts during early leaf development[J].The Plant Journal，2010，62（4）：713-725.
[5] GOTHANDAM K M，KIM E，CHO H，et al.Osppr1，a pentatricopeptide repeat protein of rice is essential for the chloroplast biogenesis[J].Plant Molecular Biology，2005，58（3）：421-433.
[6] 张向前，邹金松，朱海涛，等.水稻早熟多子房突变体fon5的遗传分析和基因定位[J].遗传，2008，30（10）：1349-1355.
[7] MICHELMORE R W，PARAN I，KESSELI R V.Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysis：a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88（21）：9828-9832.
[8] SHEN Y，JIANG H，JIN J，et al.Development of genome-wide dna polymorphism database for map-based cloning of rice genes[J].Plant Physiology，2004，135（3）：1198-1205.
[9] LANDER E S，GREEN P，ABRAHAMSON J，et al.Mapmaker：an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations[J].Genomics，1987，1（2）：174-181.
[10] IWATA N，OMURA T.Linkage studies in rice （Oryza sativa L.） some albino genes and their linkage relation with marker genes[J].Sci Bull Fac Agr Kyushu Univ，1978，33：11-18.
[11] IWATA N，SATOH H，OMURA T.Linkage analysis by use of trisomics in rice （Oryza sativa L.） IV. Linkage groups locating on chromosomes 2 and 10[J].Japan J Breed，1981，31（1）：66-67.