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【摘 要】以罗汉果鲜果为原料，通过单因素和多指标正交试验优化基于大孔吸附树脂纯化罗汉果甜苷V的工艺。结果表明：大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数为乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0，最佳工艺参数得到98.8 g高纯度天然罗汉果甜苷V产品，含量为71.1%。上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的重量与含量都具有显著的影响，同时乙醇浓度对重量也有显著影响，径高比和pH值对重量与含量影响不显著。
【关键词】罗汉果;甜苷V;正交试验;多指标;优化
【中图分类号】TS202.3 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）06-0042-03
0 引言
罗汉果甜苷V，是从罗汉果果实中提取的极甜的非糖类物质，它的甜度是蔗糖的300倍且不含任何热量，是一种不影响正常人血糖含量、安全且对人体有多种药理活性的天然甜味剂。近几年，国际市场上罗汉果甜苷V的消费量呈现强劲增长趋势，在食品饮料行业尤为显著。例如，“可口可乐”（美国）、“通用磨坊”（法国）、“乔巴尼”（美国）等大型的食品饮料企业都使用罗汉果甜苷V作为甜味剂[1]。据Innova Database最新数据公布，2011年，罗汉果甜苷V的消费量接近20 t/d，2015年消费量接近300 t/d，2017年1～5月，单在美国市场上发布的使用罗汉果苷V作为甜味剂的产品就达217种，同比增加140%。预计到2020年，全球罗汉果甜苷市场规模将从2016年的约2.5亿美元增长到超过10亿美元，年复合增长率超过40%。国家卫健委也于2017年1月1日正式实施《食品安全国家标准——食品添加剂罗汉果甜苷》，自此，罗汉果甜苷可作为食品添加剂应用于各类食品中[2]。市场研究咨询公司CCM认为，随着罗汉果甜苷特有的低糖低热量特点及其下游饮料行业的应用，预计2020年罗汉果甜苷V中国市场规模可呈现400%的增长，因此罗汉果甜苷V在国内外都具有非常大的市场前景。此外，受种植环境限制，罗汉果目前只在中国生长和培育，为了实施原产地保护，我国立法禁止将罗汉果的种子和遗传基因带出国外，因此罗汉果甜苷只能在中国生产，这对于国内的罗汉果甜苷生产企业是不可错失的机遇。
1 试验材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 原材料
罗汉果鲜果（湖南华诚生物资源股份有限公司提供）。
1.1.2 试剂
罗汉果甜苷V（≥98%）AR、无水乙醇AR、氢氧化钠AR、盐酸AR、乙腈AR等。
1.2 主要仪器
大孔吸附树脂LX-100B（陕西省西安市西安蓝晓科技新材料股份有限公司生产）、高效液相色谱仪（型号：Waters 2695）、DDSJ-308A型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司生产）、分析天平（日本岛津仪器有限公司生产）等。
2 方法
2.1 罗汉果甜苷V含量测定方法
罗汉果甜苷V含量测定依照团体标准《T/CCCMHPIE 14-2016》附录A.4中规定的方法进行测定[3]。
2.2 工艺路线
（1）罗汉果上柱液的制备：将新鲜的罗汉果通过连续逆流提取设备浸提，制得的浸提液依次过碟式分离机和陶瓷膜后，得罗汉果清液（上柱液）备用。
（2）大孔吸附树脂层析柱的准备：将1 L LX-100B型大孔吸附树脂装入玻璃层析柱内（湿法装柱），然后用4 L 95%乙醇以0.5 BV/h流速循环洗柱12 h后，用去离子水洗柱至无醇味，待用。
（3）纯化层析上柱：将制得的罗汉果上柱液调节pH后，以一定的流速上柱，流出液有甜感即停止上柱。
（4）洗柱與解吸：停止上柱后，用去离子水以1 BV/h进行洗柱至中性，然后以3倍柱体积、一定浓度的乙醇水溶液，以一定的流速解吸，收集解吸液。
（5）浓缩与干燥：将收集的解吸液进行真空浓缩和微波干燥，最后称重与检测。
2.3 数据统计与分析
数据统计采用Office 2020软件，数据分析处理采用SPSS 8.0软件。
2.4 大孔吸附树脂纯化工艺优化方法
在单因素试验的基础之上，以乙醇浓度（A）、上柱流速（B）、径高比（C）及pH值（D）4个因素3个水平做多指标正交试验表L9（34）进行试验，对制得罗汉果甜苷V重量及含量进行综合评分[4-5]。正交试验因素水平表见表1，多指标设计及结果见表2。
3 结果与分析
3.1 正交试验结果分析
对乙醇浓度（A）、上柱流速（B）、径高比（C）及pH值（D）4个单因素进行正交试验设计并针对重量和含量2个指标进行考察和分析，同时进行方差分析，从而确定罗汉果甜苷V层析的最佳工艺参数及影响主次因素顺序，其重量和含量结果见表2。
针对制得罗汉果甜苷V产品的重量情况来看，由表1可以看出，大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数为A2B3C2D3，即解吸乙醇浓度为60%、上柱流速为1.5 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。4个因素对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V影响的主次因素为B>A>D>C。说明上柱流速对制得的质量影响最大，其次是乙醇浓度，再次是pH值，最后是径高比。
针对制得罗汉果甜苷V产品的含量情况来看，由表1可以看出，大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数为：A3B1C3D3，即解吸乙醇浓度为70%、上柱流速为0.5 BV/h、径高比为1∶6.0、pH值为8.0。4个因素对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响的主次因素为A=B>D>C。即说明乙醇浓度和上柱流速对产品含量的影响最大，且两者的影响相同，其次是pH值，最后是径高比。 乙醇浓度对各指标的影响：从表3可以看出，乙醇浓度对重量和含量的极差都是最大的或者其次的，也就是说，乙醇浓度对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最大。由于高浓度乙醇成本较高，综合考虑A2和A3，选择最佳方案为A2，即乙醇浓度为60%。
上柱流速对各指标的影响：从表3可以看出，上柱流速对重量和含量的极差都是最大的或者等同，也就是说，上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最大。综合考虑B3和B1，折中选择最佳方案为B2，即上柱流速为1BV/h。
径高比对各指标的影响：从表1可以看出，径高比对重量与含量的极差都是最小的，即影响最小，也就是说，径高比对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最小，综合考虑C2和C3，折中选择最佳方案为C2，即径高比为1∶4.5。
pH值对各指标的影响：从表1可以看出，pH值对重量与含量的极差都是较大的，即影响较大，也就是说，pH值对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响较大，综合考虑D3和D3，选择最佳方案为D3，即pH值为8.0。
通过对各因素对两个指标影响的综合分析，得到理论上的最佳工艺参数为A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。
3.2 方差分析
为了判断以上4种受控因素对实驗结果的影响情况，将多指标正交表进行方差分析，找出其影响质量和含量的主要来源。正交实验的方差分析结果见表4。
由表4可以看出：A和B因素对感官评价得分的影响显著性，C和D因素对重量的影响不显著。说明乙醇浓度和上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V具有显著的影响。同时，B因素对含量的影响呈现显著性，B、C和D 3个因素对含量的影响不显著。说明上柱流速对含量具有显著影响。
综上所述，上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的重量与含量都具有显著的影响，同时乙醇浓度对重量也有显著影响，径高比和pH值对重量与含量影响不显著。
大孔吸附树脂纯化过程是一个吸附与竞争吸附的过程，大孔吸附树脂的官能团与有效成分之间必须发生有效近距离接触，同时保持一定的时间，在吸附过程中周围环境要保持相对稳定，这就需要有效成分随同上柱液保持恒定的流速流经大孔吸附树脂的孔隙，确保连续吸附，流速也不能太快，从而确保吸附完全，否则会造成上柱泄露或吸附不饱和。
乙醇作为常用的解吸溶剂，其浓度的高低直接决定最终产品的品质，浓度过高会使大量的杂质随同被解吸下来导致含量偏低，反之，浓度过低则可能会导致解吸不完全，最终产量降低。
3.3 验证试验
根据最佳工艺参数A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。重复试验，并进行质量和含量的测定，得到98.8 g、含量为71.1%的高纯度天然罗汉果甜苷V产品，与理论值预期相符。
4 结论与建议
4.1 结论
（1）大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数：乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。
（2）验证试验得到98.8 g、含量为71.1%的高纯度天然罗汉果甜苷V产品，与理论值预期相符。
（3）上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的重量与含量都具有显著的影响，同时乙醇浓度对重量也有显著影响，径高比和pH值对重量与含量影响不显著。
4.2 建议
在本试验设计过程中，在罗汉果上柱液的处理过程中，只涉及简单的提取、碟式分离和陶瓷膜过滤，没有对浸提液进行深入的除杂工艺，如脱蛋白、脱鞣质、脱去大分子等。如果能通过超滤膜、絮凝沉淀及冷冻脱蛋白等方式进行进一步的纯化，然后再进行上柱层析纯化，极可能大幅度提高纯化效果。
本试验设计只针对质量和含量进行考察，未对罗汉果甜苷V产品的食品感官进行评定。罗汉果甜苷V作为食品甜味剂，其口感滋味极为重要，口感不佳的产品很难有好的市场价值，后续试验应重点考察纯化过程对口感滋味的影响。
本试验中在解吸环节只涉及一个梯度解吸，下一步试验可以考虑多个梯度解吸，如第一次解吸用低浓度乙醇溶液，然后再用高浓度乙醇溶液解吸，同时考虑各种梯度乙醇溶液解吸对制得不同规格罗汉果甜苷V产品的口感影响，这对于未来制得高含量和口感极佳的罗汉果甜苷V产品具有重大的意义。
参 考 文 献
[1]白家峰，韦康，唐志明，等.罗汉果添加剂保润效果及其作用机理的探索[J].企业科技与发展，2019（10）：52-54，56.
[2]王晨，张思聪，王健，等.罗汉果甜苷应用研究进展及发展建议[J].现代食品，2020（14）：61-65.
[3]廖秋梅，胡志娟，李健，等.罗汉果中Vc的高效液相检测及提取方法研究[J].轻工科技，2020，36（9）：8-10，64.
[4]陈敏，王翠红.罗汉果中罗汉果皂苷提取工艺的优化及其止咳祛痰作用[J].中成药，2019，41（5）：1129-1132.
[5]黎海彬，张越华.大孔树脂吸附分离罗汉果皂苷的动力学研究[J].食品科学，2010，31（17）：124-128.
【关键词】罗汉果;甜苷V;正交试验;多指标;优化
【中图分类号】TS202.3 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）06-0042-03
0 引言
罗汉果甜苷V，是从罗汉果果实中提取的极甜的非糖类物质，它的甜度是蔗糖的300倍且不含任何热量，是一种不影响正常人血糖含量、安全且对人体有多种药理活性的天然甜味剂。近几年，国际市场上罗汉果甜苷V的消费量呈现强劲增长趋势，在食品饮料行业尤为显著。例如，“可口可乐”（美国）、“通用磨坊”（法国）、“乔巴尼”（美国）等大型的食品饮料企业都使用罗汉果甜苷V作为甜味剂[1]。据Innova Database最新数据公布，2011年，罗汉果甜苷V的消费量接近20 t/d，2015年消费量接近300 t/d，2017年1～5月，单在美国市场上发布的使用罗汉果苷V作为甜味剂的产品就达217种，同比增加140%。预计到2020年，全球罗汉果甜苷市场规模将从2016年的约2.5亿美元增长到超过10亿美元，年复合增长率超过40%。国家卫健委也于2017年1月1日正式实施《食品安全国家标准——食品添加剂罗汉果甜苷》，自此，罗汉果甜苷可作为食品添加剂应用于各类食品中[2]。市场研究咨询公司CCM认为，随着罗汉果甜苷特有的低糖低热量特点及其下游饮料行业的应用，预计2020年罗汉果甜苷V中国市场规模可呈现400%的增长，因此罗汉果甜苷V在国内外都具有非常大的市场前景。此外，受种植环境限制，罗汉果目前只在中国生长和培育，为了实施原产地保护，我国立法禁止将罗汉果的种子和遗传基因带出国外，因此罗汉果甜苷只能在中国生产，这对于国内的罗汉果甜苷生产企业是不可错失的机遇。
1 试验材料与仪器
1.1 材料
1.1.1 原材料
罗汉果鲜果（湖南华诚生物资源股份有限公司提供）。
1.1.2 试剂
罗汉果甜苷V（≥98%）AR、无水乙醇AR、氢氧化钠AR、盐酸AR、乙腈AR等。
1.2 主要仪器
大孔吸附树脂LX-100B（陕西省西安市西安蓝晓科技新材料股份有限公司生产）、高效液相色谱仪（型号：Waters 2695）、DDSJ-308A型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司生产）、分析天平（日本岛津仪器有限公司生产）等。
2 方法
2.1 罗汉果甜苷V含量测定方法
罗汉果甜苷V含量测定依照团体标准《T/CCCMHPIE 14-2016》附录A.4中规定的方法进行测定[3]。
2.2 工艺路线
（1）罗汉果上柱液的制备：将新鲜的罗汉果通过连续逆流提取设备浸提，制得的浸提液依次过碟式分离机和陶瓷膜后，得罗汉果清液（上柱液）备用。
（2）大孔吸附树脂层析柱的准备：将1 L LX-100B型大孔吸附树脂装入玻璃层析柱内（湿法装柱），然后用4 L 95%乙醇以0.5 BV/h流速循环洗柱12 h后，用去离子水洗柱至无醇味，待用。
（3）纯化层析上柱：将制得的罗汉果上柱液调节pH后，以一定的流速上柱，流出液有甜感即停止上柱。
（4）洗柱與解吸：停止上柱后，用去离子水以1 BV/h进行洗柱至中性，然后以3倍柱体积、一定浓度的乙醇水溶液，以一定的流速解吸，收集解吸液。
（5）浓缩与干燥：将收集的解吸液进行真空浓缩和微波干燥，最后称重与检测。
2.3 数据统计与分析
数据统计采用Office 2020软件，数据分析处理采用SPSS 8.0软件。
2.4 大孔吸附树脂纯化工艺优化方法
在单因素试验的基础之上，以乙醇浓度（A）、上柱流速（B）、径高比（C）及pH值（D）4个因素3个水平做多指标正交试验表L9（34）进行试验，对制得罗汉果甜苷V重量及含量进行综合评分[4-5]。正交试验因素水平表见表1，多指标设计及结果见表2。
3 结果与分析
3.1 正交试验结果分析
对乙醇浓度（A）、上柱流速（B）、径高比（C）及pH值（D）4个单因素进行正交试验设计并针对重量和含量2个指标进行考察和分析，同时进行方差分析，从而确定罗汉果甜苷V层析的最佳工艺参数及影响主次因素顺序，其重量和含量结果见表2。
针对制得罗汉果甜苷V产品的重量情况来看，由表1可以看出，大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数为A2B3C2D3，即解吸乙醇浓度为60%、上柱流速为1.5 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。4个因素对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V影响的主次因素为B>A>D>C。说明上柱流速对制得的质量影响最大，其次是乙醇浓度，再次是pH值，最后是径高比。
针对制得罗汉果甜苷V产品的含量情况来看，由表1可以看出，大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数为：A3B1C3D3，即解吸乙醇浓度为70%、上柱流速为0.5 BV/h、径高比为1∶6.0、pH值为8.0。4个因素对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响的主次因素为A=B>D>C。即说明乙醇浓度和上柱流速对产品含量的影响最大，且两者的影响相同，其次是pH值，最后是径高比。 乙醇浓度对各指标的影响：从表3可以看出，乙醇浓度对重量和含量的极差都是最大的或者其次的，也就是说，乙醇浓度对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最大。由于高浓度乙醇成本较高，综合考虑A2和A3，选择最佳方案为A2，即乙醇浓度为60%。
上柱流速对各指标的影响：从表3可以看出，上柱流速对重量和含量的极差都是最大的或者等同，也就是说，上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最大。综合考虑B3和B1，折中选择最佳方案为B2，即上柱流速为1BV/h。
径高比对各指标的影响：从表1可以看出，径高比对重量与含量的极差都是最小的，即影响最小，也就是说，径高比对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响最小，综合考虑C2和C3，折中选择最佳方案为C2，即径高比为1∶4.5。
pH值对各指标的影响：从表1可以看出，pH值对重量与含量的极差都是较大的，即影响较大，也就是说，pH值对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的影响较大，综合考虑D3和D3，选择最佳方案为D3，即pH值为8.0。
通过对各因素对两个指标影响的综合分析，得到理论上的最佳工艺参数为A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。
3.2 方差分析
为了判断以上4种受控因素对实驗结果的影响情况，将多指标正交表进行方差分析，找出其影响质量和含量的主要来源。正交实验的方差分析结果见表4。
由表4可以看出：A和B因素对感官评价得分的影响显著性，C和D因素对重量的影响不显著。说明乙醇浓度和上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V具有显著的影响。同时，B因素对含量的影响呈现显著性，B、C和D 3个因素对含量的影响不显著。说明上柱流速对含量具有显著影响。
综上所述，上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的重量与含量都具有显著的影响，同时乙醇浓度对重量也有显著影响，径高比和pH值对重量与含量影响不显著。
大孔吸附树脂纯化过程是一个吸附与竞争吸附的过程，大孔吸附树脂的官能团与有效成分之间必须发生有效近距离接触，同时保持一定的时间，在吸附过程中周围环境要保持相对稳定，这就需要有效成分随同上柱液保持恒定的流速流经大孔吸附树脂的孔隙，确保连续吸附，流速也不能太快，从而确保吸附完全，否则会造成上柱泄露或吸附不饱和。
乙醇作为常用的解吸溶剂，其浓度的高低直接决定最终产品的品质，浓度过高会使大量的杂质随同被解吸下来导致含量偏低，反之，浓度过低则可能会导致解吸不完全，最终产量降低。
3.3 验证试验
根据最佳工艺参数A2B2C2D3，即乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。重复试验，并进行质量和含量的测定，得到98.8 g、含量为71.1%的高纯度天然罗汉果甜苷V产品，与理论值预期相符。
4 结论与建议
4.1 结论
（1）大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的最佳工艺参数：乙醇浓度为60%、上柱流速为1 BV/h、径高比为1∶4.5、pH值为8.0。
（2）验证试验得到98.8 g、含量为71.1%的高纯度天然罗汉果甜苷V产品，与理论值预期相符。
（3）上柱流速对大孔吸附树脂层析纯化罗汉果甜苷V的重量与含量都具有显著的影响，同时乙醇浓度对重量也有显著影响，径高比和pH值对重量与含量影响不显著。
4.2 建议
在本试验设计过程中，在罗汉果上柱液的处理过程中，只涉及简单的提取、碟式分离和陶瓷膜过滤，没有对浸提液进行深入的除杂工艺，如脱蛋白、脱鞣质、脱去大分子等。如果能通过超滤膜、絮凝沉淀及冷冻脱蛋白等方式进行进一步的纯化，然后再进行上柱层析纯化，极可能大幅度提高纯化效果。
本试验设计只针对质量和含量进行考察，未对罗汉果甜苷V产品的食品感官进行评定。罗汉果甜苷V作为食品甜味剂，其口感滋味极为重要，口感不佳的产品很难有好的市场价值，后续试验应重点考察纯化过程对口感滋味的影响。
本试验中在解吸环节只涉及一个梯度解吸，下一步试验可以考虑多个梯度解吸，如第一次解吸用低浓度乙醇溶液，然后再用高浓度乙醇溶液解吸，同时考虑各种梯度乙醇溶液解吸对制得不同规格罗汉果甜苷V产品的口感影响，这对于未来制得高含量和口感极佳的罗汉果甜苷V产品具有重大的意义。
参 考 文 献
[1]白家峰，韦康，唐志明，等.罗汉果添加剂保润效果及其作用机理的探索[J].企业科技与发展，2019（10）：52-54，56.
[2]王晨，张思聪，王健，等.罗汉果甜苷应用研究进展及发展建议[J].现代食品，2020（14）：61-65.
[3]廖秋梅，胡志娟，李健，等.罗汉果中Vc的高效液相检测及提取方法研究[J].轻工科技，2020，36（9）：8-10，64.
[4]陈敏，王翠红.罗汉果中罗汉果皂苷提取工艺的优化及其止咳祛痰作用[J].中成药，2019，41（5）：1129-1132.
[5]黎海彬，张越华.大孔树脂吸附分离罗汉果皂苷的动力学研究[J].食品科学，2010，31（17）：124-128.