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第一部分:CNTNAP4在TLE患者及癫痫动物脑组织中的表达目的:检测CNTNAP4在TLE患者及慢性戊四氮点燃模型、匹罗卡品诱导的癫痫模型小鼠脑组织中的表达情况。方法:1.从本课题组难治性癫痫患者术后脑组织标本库中随机抽取20例TLE患者颞叶皮层作为实验组,10例脑外伤术后患者颞叶皮层作为对照组。2.使用SPF级雄性C57BL/6小鼠,分为PTZ慢性点燃模型组及匹罗卡品诱导的癫痫模型组。PTZ慢性点燃模型组中经PTZ点燃的小鼠为癫痫组,未经PTZ诱发的小鼠作为对照组。匹罗卡品诱导的癫痫模型组中分为SRSs组和non-SRSs组。每组n=11。3.用qRT-PCR、western blot检测CNTNAP4的表达,用免疫荧光检测CNTNAP4在脑内表达部位。结果:1.qRT-PCR检测发现TLE患者颞叶皮层CNTNAP4 mRNA较对照组表达降低(p<0.01);PTZ慢性点燃模型小鼠癫痫组颞叶皮层和海马的CNTNAP4 mRNA表达均较对照组下降(均为p<0.05);匹罗卡品诱导的癫痫模型SRSs组小鼠颞叶皮层和海马CNTNAP4 mRNA表达也均较non-SRSs组减低(分别为p<0.05和p<0.01)。2.Western blot发现TLE患者颞叶皮层CNTNAP4蛋白表达较对照组减少(p<0.05);PTZ慢性点燃模型癫痫组小鼠颞叶皮层和海马CNTNAP4蛋白表达较对照组减低(分别为p<0.05、p<0.01);匹罗卡品诱导的癫痫模型中SRSs组小鼠颞叶皮层和海马CNTNAP4蛋白表达也均较non-SRSs组减少(分别为p<0.05、p<0.01)。3.免疫荧光显示在TLE患者颞叶皮层及癫痫模型小鼠脑组织中CNTNAP4与抑制性神经元突触共表达,而与兴奋性神经元突触没有共表达。结论:CNTNAP4在TLE患者及两种癫痫动物模型小鼠脑组织中表达均下降,且CNTNAP4在抑制性神经元突触表达,提示CNTNAP4可能参与了癫痫。第二部分:干扰和过表达CNTNAP4后对癫痫动物行为学的影响目的:研究CNTNAP4干扰慢病毒(LV-CNTNAP4-RNAi)和过表达慢病毒(LV-CNTNAP4)干预小鼠海马CNTNAP4后对小鼠癫痫行为学的影响。方法:1.构建CNTNAP4干扰和过表达慢病毒载体,慢病毒载体小鼠海马立体定位注射后14天用共聚焦显微镜、qRT-PCR及western blot检测慢病毒干预海马CNTNAP4的效率。2.SPF级雄性C57BL/6小鼠,分为LV-CNTNAP4-RNAi组和LV-GFP组、LV-CNTNAP4组和LV-GFP’组。每组小鼠在慢病毒载体注射14天后行慢性戊四氮点燃及匹罗卡品诱导的癫痫模型造模。慢性戊四氮点燃模型小鼠观察每日发作级别及点燃的潜伏期,匹罗卡品诱导的癫痫模型小鼠观察慢性期4级或5级SRSs的潜伏期、发作次数。并用电生理记录仪记录匹罗卡品诱导的癫痫小鼠的脑电图。3.各组小鼠慢病毒载体海马定位注射后6周,即行为学观察完毕后用western blot检测慢病毒干预海马CNTNAP4的效率。结果:1.LV-CNTNAP4-RNAi和LV-CNTNAP4海马立体定向注射后14天共聚焦显微镜示慢病毒成功转染入小鼠海马神经细胞内,且qRT-PCR及western blot检测其能有效干预内源性CNTNAP4的表达。2.慢病毒干预14天后行PTZ慢性点燃模型造模,发现LV-CNTNAP4-RNAi组小鼠每日平均发作级别较LV-GFP组增高,点燃的潜伏期较LV-GFP组缩短(p<0.01),而LV-CNTNAP4组小鼠较LV-GFP’组每日平均发作级别减低、点燃的潜伏期则延长(p<0.01)。3.慢病毒干预14天后行匹罗卡品诱导的癫痫模型造模,发现LV-CNTNAP4-RNAi组小鼠SRSs的次数较LV-GFP组增高(p<0.01),SRSs的潜伏期较LV-GFP组缩短(p<0.01),而LV-CNTNAP4组小鼠较LV-GFP’组SRSs次数减少(p<0.05),SRSs的潜伏期则较LV-GFP’组增加(p<0.05)。脑电图记录仪记录到匹罗卡品诱导的癫痫小鼠出现癫痫样放电和自发发作。4.Western blot检测发现慢病毒载体海马定位注射后6周(即行为学观察完毕后)仍能有效干预小鼠海马内源性CNTNAP4的表达。结论:LV-CNTNAP4-RNAi和LV-CNTNAP4干预小鼠海马内源性CNTNAP4后影响小鼠癫痫的易感性,行为学研究支持CNTNAP4参与了癫痫。第三部分:CNTNAP4在癫痫中的作用机制目的:研究癫痫小鼠脑组织中CNTNAP4参与癫痫的可能机制。方法:1.SPF级雄性C57BL/6小鼠,分为LV-CNTNAP4-RNAi组和LV-GFP组、LV-CNTNAP4组和LV-GFP’组,慢病毒载体海马立体定向注射后14天行海马脑片全细胞膜片钳电生理检测,在无镁癫痫细胞模型中检测AP、mIPSC、mEPSC、PPR及tonic GABA能电流。2.LV-CNTNAP4-RNAi组和LV-GFP组、LV-CNTNAP4组和LV-GFP’组小鼠(每组n=6),慢病毒载体海马立体定向注射后14天行匹罗卡品癫痫模型造模,各组小鼠海马组织用于提取总蛋白和膜蛋白,用western blot检测各组GABA_ARβ2/3总蛋白及膜蛋白表达情况。3.匹罗卡品诱导的癫痫模型小鼠海马组织用于免疫共沉淀检测,检测CNTNAP4与GABA_ARβ2/3、GABAR转运辅助蛋白(GABARAP)的相互作用。结果:1.全细胞膜片钳检测发现在无镁癫痫细胞模型中LV-CNTNAP4-RNAi增加海马脑片AP的频率(p<0.01)、降低mIPSC波幅(p<0.05),LV-CNTNAP4则降低AP频率(p<0.05)及增加mIPSC波幅(p<0.05),而均对mIPSC的频率无影响(p>0.05),且干预CNTNAP4后对mEPSC的波幅及频率、PPR和tonic GABA能电流均无影响(p>0.05)。2.Western blot检测发现LV-CNTNAP4-RNAi组和LV-GFP组比较GABA_ARβ2/3总蛋白表达无明显差异(p>0.05),而GABA_ARβ2/3膜蛋白表达减少(p<0.05);LV-CNTNAP4组和LV-GFP’组比较GABA_ARβ2/3总蛋白表达也无明显差异(p>0.05),而GABA_ARβ2/3膜蛋白表达增高(p<0.05)。3.免疫共沉淀检测发现癫痫小鼠海马组织中CNTNAP4与GABA_ARβ2/3、GABARAP三者均有相互作用。结论:在癫痫细胞模型中,CNTNAP4影响了神经元的兴奋性,且通过突触后的突触内受体机制影响抑制性突触传递;在癫痫动物模型中,CNTNAP4可能通过与GABARAP相互作用参与GABA_AR的转运,影响其在膜上的表达,随之影响GABA_AR介导的抑制性突触电流及神经元的兴奋性,从而引起癫痫。