论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：研究美洲大蠊提取物CⅡ-3对正常家兔血常规和血清抗氧化能力的影响。方法：给予正常家兔高（16mg/kg）、中（8mg/kg）、低（4mg/kg）耳缘静脉注射CⅡ-3，对各剂量组血常规和血清中抗氧化因子活性进行测定。结果：单次给药后，高剂量CⅡ-3能够明显降低正常家兔血液中白细胞、红细胞的数量（P<005）；多次给药后，与NS组比较，CⅡ-3对CAT、MPO的含量及T-AOC活性均有一定的提高作用（P<005）。结论：美洲大蠊提取物CⅡ-3具有一定的抗炎和抗氧化活性。
【关键词】 美洲大蠊；血常规；抗炎；抗氧化
【中图分类号】R967 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0036-03
美洲大蠊（Periplaneta americana L.）为蜚蠊目蜚蠊科昆虫，俗称蟑螂。据《本草纲目》记载，蟑螂以干燥或新鲜全体入药，有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效[1]。自20世纪70年代以来，国内外学者从其体内分离纯化出多种活性物质，如与组织再生有关的p10蛋白[2]、促进血细胞吸收感染细菌的防御型分子脂多糖结合蛋白[3]以及具有利尿作用的多肽[4]等。并开发了美洲大蠊系列昆虫药品，如康复新液、心脉隆注射液和肝龙胶囊等[5]。实验通过测定美洲大蠊醇提取物CⅡ-3对家兔外周血细胞因子和血清液中抗氧化因子的含量，进一步阐明美洲大蠊的抗炎及抗氧化作用，为其进一步研究提供参考。
1 仪器与材料
11 美洲大蠊提取物的制备 受试药物CⅡ-3（批号：20140823，由大理大学药学院刘光明教授提供）为棕褐色冻干粉末，其制备过程如下：用溶剂提取粉碎后的美洲大蠊虫体干品，浓缩回收溶剂，得到的浓缩液经大孔吸附树脂材料柱层析，水洗，然后用醇溶剂洗脱，所得洗脱液经减压浓缩至无醇味，干燥后得到产品CⅡ-3[6]。实验前受试药物用生理盐水分别配制成不同浓度的药液，然后用022 μm的微孔滤膜进行过滤灭菌。
12 动物与试剂 家兔42只，体重15～20kg，由大理大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（滇）2011-0004，普通级别。过氧化氢酶（CAT，批号：20150707）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：20150421）、髓过氧化物酶（MPO，批号：20150415）、总抗氧化能力（T-AOC，批号：20150706）等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；XFA6000动物血细胞分析仪用稀释液（批号：PD1501）、HB探针清洗液（批号：PB9407）；ANI-3D溶血剂（批号：PF2402）；HB含酶清洗液（批号：PB7501）等购自南京普朗医疗设备有限公司。
13 仪器 TL-16R高速冷冻离心机（上海市离心机机械研究所）；EMP-168G半自动生化分析仪（深圳市恩普电子技术有限公司）；XFA6000全自动动物血细胞分析仪（南京普朗医疗设备有限公司）。
2 方法
21 单次给药对家兔血细胞含量的影响 体重15～20kg健康雄性家兔18只，随机分为3组，每组6只，即CⅡ-3高（16mg/kg）、中（8mg/kg）、低（4mg/kg）剂量组。各组家兔按给药量2mL/kg通过耳缘静脉给药1次，分别于给药前，给药后5、15、30、60、120、240min耳缘静脉采血20μL，全自动血细胞分析仪上检测不同时间点家兔血液中白细胞、红细胞、血小板等含量的变化。
22 连续给药对家兔血清中抗氧化因子含量的影响 体重15～20kg健康雄性家兔24只，按体重随机分为4组，每组6只，分别为3个给药组（与21中相同）和1个生理盐水对照组（NS组）。给药组家兔每日耳缘静脉给药，给药量均为2mL/kg，NS组给予生理盐水，连续给药5d。末次给药后24 h，心脏采血5 mL，并分离血清，参照试剂盒说明书分别测定血清中过氧化氢酶（Catalase；CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Myeloperoxidase；GSH-PX）、髓过氧化物酶（Myeloperodidase；MPO）的含量以及血清总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity ；T-AOC）的活性。
23 数据分析 采用SPSS170分析软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，单次给药数据采用配对t检验，多次给药数据均数的比较用单因素方差分析，P<005为差异具有统计学意义。
3 结果
31 单次给药美洲大蠊提取物CⅡ-3对家兔血细胞含量的影响
311 单次给药后CⅡ-3对家兔白细胞含量的影响 与给药前比较，给药后30、60min时，高剂量组家兔血液中白细胞含量明显降低，差异有统计学意义（P<005）。结果见表1。
312 单次给药CⅡ-3对家兔红细胞含量的影响 与给药前比较，给药后240min时高剂量CⅡ-3组红细胞数量的减少较明显，差异有统计学意义（P<005）。结果见表 2。
313 单次给药CⅡ-3对家兔血小板含量的影响 与给药前比较，CⅡ-3各剂量组对家兔血小板的影响不明显，差异无统计学意义（P>005）。结果见表 3。
32 多次给药CⅡ-3对正常家兔血清中抗氧化因子含量的影响 与NS组比较，CⅡ-3能够明显增强正常家兔血清中MPO的活性，差异有统计学意义（P<005）。低剂量、中剂量CⅡ-3能使血清中CAT的含量显著增加，差异有统计学意义（P<005），中剂量CⅡ-3还可以显著提高血清中T-AOC的活性，差异有统计学意义（P<005）；另外，高剂量CⅡ-3也能提高血清中GSH-PX的含量，但差异不具有统计学意义（P>005）。结果见表4。
4 讨论
血常规检查是血液细胞部分的检查，也是临床一项基本的常规检查[7-8]。根据其数量和分布的变化，可以作为疾病诊断的辅助手段。红细胞各项参数出现异常时，可对一些疾病的诊断提供依据。白细胞可以保护机体避免各种病毒性和细菌性感染，以及其他异物的入侵[9]。有证据表明[10]，血小板对急性炎症和损伤，包括类风湿性关节炎、脑型疟和急性肺损伤等起主要作用。试验中，高剂量CⅡ-3能够降低正常家兔血液中白细胞、红细胞的数量，提示其具有一定的抗炎作用。 过氧化氢酶（CAT）能够刺激H2O2生成水并且可以清除机体氢过氧化物，且过氧化氢酶利用H2O2可以氧化一些毒素，包括酚类、甲酸、甲醛和酒精等[11]。过氧化氢作为机体代谢过程中产生的废物，能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质，而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。实验结果显示，与NS组相比，低、中剂量CⅡ-3能够明显增强家兔血清中过氧化物酶的活力（P<005）。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体内广泛存在的抗氧化酶，它在信号平衡、免疫调节[12]，以及清除氢过氧化物，避免氧化损伤中发挥重要作用[13-14]。实验中，中、高剂量CⅡ-3可以增加家兔血清中谷胱甘肽过氧化物酶的含量。髓过氧化物酶（MPO）存在于吞噬细胞中，是抗微生物系统和炎症调节的基本成分[15]，其活性的变化可对早期组织损伤做出较敏感的反应[16]。作为中性粒细胞和单核细胞的标志酶[17]，其水平与细胞数量成正比，与血常规中的中性粒细胞和单核细胞数的增加一致；且根据实验发现，各剂量CⅡ-3均能明显提高家兔血清中MPO的活性（P<005）。而从整体抗氧化水平而言，总抗氧化能力（T-AOC）对防御体的抗氧化作用主要通过消除自由基和活性氧，分解过氧化物，去除催化作用的金属离子等来实现。结果发现，中剂量CⅡ-3能够明显增加家兔血清中T-AOC水平（P<005）。根据所测定家兔血清中抗氧化因子的活性和水平，可以认为CⅡ-3具有一定的体内抗氧化作用。
实验通过对正常家兔外周血细胞含量及抗氧化因子进行测定，结果显示，给予美洲大蠊提取物CⅡ-3后，正常家兔血液中白细胞、红细胞数量减少，对抗氧化因子MPO、CAT、GSH-PX、T-AOC具有一定的提高作用，从而表明美洲大蠊提取物CⅡ-3具有一定的抗炎、抗氧化作用，这一结果将为美洲大蠊的下一步研究提供理论依据。
参考文献
[1]李玉和. 虫类药治疗疑难病证的临床研究[J]. 中医药信息，1998，11（4）：21-23.
[2]Nomura A， Kawasaki K， Kubo T， et al. Purification and localization of p10， a novel protein that increases in nymphal regenerating legs of Periplaneta americana （American cockroach）[J]. The International Journal of Developmental Biology， 1992， 36（3）： 391-398.
[3]Jomori T， Natori S. Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin[J]. FEBS Letters， 1992， 296（3）： 283-286.
[4]Kay I， Patel M， Coast GM， et al. Isolation， characterization and biological activity of a CRF-related diuretic peptide from Periplaneta americana L[J]. Regulatory Peptides， 1992， 42（3）： 111-122.
[5]何正春，彭芳，宋丽艳，等. 美洲大蠊化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国中药杂志，2007，32（21）：2326-2331.
[6]大理学院. 大孔吸附树脂制备的美洲大蠊抗肿瘤有效部位及用途[P]. 中国发明专利，CN101214262. 2008-07-09.
[7]费树强. 血常规检查的临床意义分析[J]. 大家健康，2014，8（16）：53-54.
[8]杨志明. C-反应蛋白和血常规测定的临床意义[J]. 实用中西医结合临床，2014，14（9）：51-52.
【关键词】 美洲大蠊；血常规；抗炎；抗氧化
【中图分类号】R967 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0036-03
美洲大蠊（Periplaneta americana L.）为蜚蠊目蜚蠊科昆虫，俗称蟑螂。据《本草纲目》记载，蟑螂以干燥或新鲜全体入药，有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效[1]。自20世纪70年代以来，国内外学者从其体内分离纯化出多种活性物质，如与组织再生有关的p10蛋白[2]、促进血细胞吸收感染细菌的防御型分子脂多糖结合蛋白[3]以及具有利尿作用的多肽[4]等。并开发了美洲大蠊系列昆虫药品，如康复新液、心脉隆注射液和肝龙胶囊等[5]。实验通过测定美洲大蠊醇提取物CⅡ-3对家兔外周血细胞因子和血清液中抗氧化因子的含量，进一步阐明美洲大蠊的抗炎及抗氧化作用，为其进一步研究提供参考。
1 仪器与材料
11 美洲大蠊提取物的制备 受试药物CⅡ-3（批号：20140823，由大理大学药学院刘光明教授提供）为棕褐色冻干粉末，其制备过程如下：用溶剂提取粉碎后的美洲大蠊虫体干品，浓缩回收溶剂，得到的浓缩液经大孔吸附树脂材料柱层析，水洗，然后用醇溶剂洗脱，所得洗脱液经减压浓缩至无醇味，干燥后得到产品CⅡ-3[6]。实验前受试药物用生理盐水分别配制成不同浓度的药液，然后用022 μm的微孔滤膜进行过滤灭菌。
12 动物与试剂 家兔42只，体重15～20kg，由大理大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（滇）2011-0004，普通级别。过氧化氢酶（CAT，批号：20150707）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：20150421）、髓过氧化物酶（MPO，批号：20150415）、总抗氧化能力（T-AOC，批号：20150706）等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；XFA6000动物血细胞分析仪用稀释液（批号：PD1501）、HB探针清洗液（批号：PB9407）；ANI-3D溶血剂（批号：PF2402）；HB含酶清洗液（批号：PB7501）等购自南京普朗医疗设备有限公司。
13 仪器 TL-16R高速冷冻离心机（上海市离心机机械研究所）；EMP-168G半自动生化分析仪（深圳市恩普电子技术有限公司）；XFA6000全自动动物血细胞分析仪（南京普朗医疗设备有限公司）。
2 方法
21 单次给药对家兔血细胞含量的影响 体重15～20kg健康雄性家兔18只，随机分为3组，每组6只，即CⅡ-3高（16mg/kg）、中（8mg/kg）、低（4mg/kg）剂量组。各组家兔按给药量2mL/kg通过耳缘静脉给药1次，分别于给药前，给药后5、15、30、60、120、240min耳缘静脉采血20μL，全自动血细胞分析仪上检测不同时间点家兔血液中白细胞、红细胞、血小板等含量的变化。
22 连续给药对家兔血清中抗氧化因子含量的影响 体重15～20kg健康雄性家兔24只，按体重随机分为4组，每组6只，分别为3个给药组（与21中相同）和1个生理盐水对照组（NS组）。给药组家兔每日耳缘静脉给药，给药量均为2mL/kg，NS组给予生理盐水，连续给药5d。末次给药后24 h，心脏采血5 mL，并分离血清，参照试剂盒说明书分别测定血清中过氧化氢酶（Catalase；CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Myeloperoxidase；GSH-PX）、髓过氧化物酶（Myeloperodidase；MPO）的含量以及血清总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity ；T-AOC）的活性。
23 数据分析 采用SPSS170分析软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，单次给药数据采用配对t检验，多次给药数据均数的比较用单因素方差分析，P<005为差异具有统计学意义。
3 结果
31 单次给药美洲大蠊提取物CⅡ-3对家兔血细胞含量的影响
311 单次给药后CⅡ-3对家兔白细胞含量的影响 与给药前比较，给药后30、60min时，高剂量组家兔血液中白细胞含量明显降低，差异有统计学意义（P<005）。结果见表1。
312 单次给药CⅡ-3对家兔红细胞含量的影响 与给药前比较，给药后240min时高剂量CⅡ-3组红细胞数量的减少较明显，差异有统计学意义（P<005）。结果见表 2。
313 单次给药CⅡ-3对家兔血小板含量的影响 与给药前比较，CⅡ-3各剂量组对家兔血小板的影响不明显，差异无统计学意义（P>005）。结果见表 3。
32 多次给药CⅡ-3对正常家兔血清中抗氧化因子含量的影响 与NS组比较，CⅡ-3能够明显增强正常家兔血清中MPO的活性，差异有统计学意义（P<005）。低剂量、中剂量CⅡ-3能使血清中CAT的含量显著增加，差异有统计学意义（P<005），中剂量CⅡ-3还可以显著提高血清中T-AOC的活性，差异有统计学意义（P<005）；另外，高剂量CⅡ-3也能提高血清中GSH-PX的含量，但差异不具有统计学意义（P>005）。结果见表4。
4 讨论
血常规检查是血液细胞部分的检查，也是临床一项基本的常规检查[7-8]。根据其数量和分布的变化，可以作为疾病诊断的辅助手段。红细胞各项参数出现异常时，可对一些疾病的诊断提供依据。白细胞可以保护机体避免各种病毒性和细菌性感染，以及其他异物的入侵[9]。有证据表明[10]，血小板对急性炎症和损伤，包括类风湿性关节炎、脑型疟和急性肺损伤等起主要作用。试验中，高剂量CⅡ-3能够降低正常家兔血液中白细胞、红细胞的数量，提示其具有一定的抗炎作用。 过氧化氢酶（CAT）能够刺激H2O2生成水并且可以清除机体氢过氧化物，且过氧化氢酶利用H2O2可以氧化一些毒素，包括酚类、甲酸、甲醛和酒精等[11]。过氧化氢作为机体代谢过程中产生的废物，能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质，而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。实验结果显示，与NS组相比，低、中剂量CⅡ-3能够明显增强家兔血清中过氧化物酶的活力（P<005）。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体内广泛存在的抗氧化酶，它在信号平衡、免疫调节[12]，以及清除氢过氧化物，避免氧化损伤中发挥重要作用[13-14]。实验中，中、高剂量CⅡ-3可以增加家兔血清中谷胱甘肽过氧化物酶的含量。髓过氧化物酶（MPO）存在于吞噬细胞中，是抗微生物系统和炎症调节的基本成分[15]，其活性的变化可对早期组织损伤做出较敏感的反应[16]。作为中性粒细胞和单核细胞的标志酶[17]，其水平与细胞数量成正比，与血常规中的中性粒细胞和单核细胞数的增加一致；且根据实验发现，各剂量CⅡ-3均能明显提高家兔血清中MPO的活性（P<005）。而从整体抗氧化水平而言，总抗氧化能力（T-AOC）对防御体的抗氧化作用主要通过消除自由基和活性氧，分解过氧化物，去除催化作用的金属离子等来实现。结果发现，中剂量CⅡ-3能够明显增加家兔血清中T-AOC水平（P<005）。根据所测定家兔血清中抗氧化因子的活性和水平，可以认为CⅡ-3具有一定的体内抗氧化作用。
实验通过对正常家兔外周血细胞含量及抗氧化因子进行测定，结果显示，给予美洲大蠊提取物CⅡ-3后，正常家兔血液中白细胞、红细胞数量减少，对抗氧化因子MPO、CAT、GSH-PX、T-AOC具有一定的提高作用，从而表明美洲大蠊提取物CⅡ-3具有一定的抗炎、抗氧化作用，这一结果将为美洲大蠊的下一步研究提供理论依据。
参考文献
[1]李玉和. 虫类药治疗疑难病证的临床研究[J]. 中医药信息，1998，11（4）：21-23.
[2]Nomura A， Kawasaki K， Kubo T， et al. Purification and localization of p10， a novel protein that increases in nymphal regenerating legs of Periplaneta americana （American cockroach）[J]. The International Journal of Developmental Biology， 1992， 36（3）： 391-398.
[3]Jomori T， Natori S. Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin[J]. FEBS Letters， 1992， 296（3）： 283-286.
[4]Kay I， Patel M， Coast GM， et al. Isolation， characterization and biological activity of a CRF-related diuretic peptide from Periplaneta americana L[J]. Regulatory Peptides， 1992， 42（3）： 111-122.
[5]何正春，彭芳，宋丽艳，等. 美洲大蠊化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国中药杂志，2007，32（21）：2326-2331.
[6]大理学院. 大孔吸附树脂制备的美洲大蠊抗肿瘤有效部位及用途[P]. 中国发明专利，CN101214262. 2008-07-09.
[7]费树强. 血常规检查的临床意义分析[J]. 大家健康，2014，8（16）：53-54.
[8]杨志明. C-反应蛋白和血常规测定的临床意义[J]. 实用中西医结合临床，2014，14（9）：51-52.