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摘要：甘薯采后贮藏期短，在采后贮运过程中极易腐败变质，从而影响甘薯的品质，造成大量损失。因此，研究不同耐贮性甘薯的生理生化指标差异具有重要的理论与实践价值。以耐贮藏甘薯品种南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18和不耐贮藏甘薯品种徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯为试验材料，考察甘薯叶片中抗氧化酶活性及活性氧（ROS）含量的差异，解析抗氧化代谢与甘薯耐贮性的相关性。结果表明，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮的甘薯品种抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性较高，脂氧合酶（LOX）活性、丙二醛（MDA）含量、过氧化氢（H2O2）含量和超氧阴离子（O-2·）产生速率相对较低。热图分析结果显示，耐贮藏甘薯品种的叶片抗氧化酶活性相对较高，活性氧含量相对较低，不耐贮藏甘薯品种的叶片抗氧化酶活性相对较低，活性氧含量相对较高。主成分分析结果表明，不同耐贮性的甘薯品种中抗氧化能力和贮藏性能之间呈正相关。相关性分析结果显示，不同抗氧化酶之间有着较高的正相关系数，而与LOX活性、H2O2含量、O-2·產生速率、MDA含量呈明显负相关。由此可见，耐贮藏甘薯品种较不耐贮藏甘薯品种有着更好的抗氧化能力。研究结果为耐贮甘薯的选育提供了理论参考。
关键词：甘薯;贮藏;活性氧自由基;抗氧化酶;相关性分析
中图分类号： S531.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0162-06
甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]属旋花科甘薯属，富含维生素、矿物质、膳食纤维、必需脂肪酸及抗氧化剂等[1]。甘薯是重要的低投入、高产出、耐干旱、耐脊薄、多用途的粮食、饲料及工业原料作物和新型的生物能源作物[2]。甘薯主要以块根为利用对象，因其体积大、含水量高，在运输和贮藏过程中的损失严重，从而限制了甘薯产业的发展。
影响甘薯种薯贮藏的主要因素有薯块自身的生理变化、病菌侵染和贮藏环境条件等[3]。呼吸作用可造成植物细胞内活性氧（reactive oxygen species，简称ROS）的产生和积累，而植物体内的活性氧主要以自由基、非自由基形式存在，ROS主要包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、脂质过氧化物和单线态氧[4]。ROS通常被认为是有氧代谢的副产物，其产生的主要部位是线粒体和叶绿体中的电子传递链。当电子传递到氧（O2）时，就会产生ROS，而且逆境胁迫会加剧ROS的积累[5]。ROS介导的氧化应激可对植物细胞造成氧化胁迫，使其呈现多种有害的细胞学效应，如生物膜过氧化、细胞核受损、氨基酸氧化、蛋白质变性、DNA链断裂、色素破坏、光合作用受阻、呼吸作用异常、酶失活及植物生长素IAA分解等[6-7]。抗氧化酶系主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）等[8-9]，可以将体内形成的过氧化物转换为毒害较低或无害的物质。在正常条件下，植物细胞中产生的ROS可通过体内抗氧化酶介导的酶促反应清除系统维持在相对稳定的水平。抗氧化酶可以清除活性氧及氧化中间体，在果实采后贮藏过程中起着重要作用，这种平衡可能也会因抗氧化酶的消耗或ROS的过量积累而被打断，导致氧化应激，从而对细胞大分子和生物膜造成损害并促进脂质过氧化。膜脂过氧化的产物丙二醛（MDA）可以使细胞膜上的蛋白发生氧化并交联，导致蛋白失活，形成细胞膜空隙，进一步破坏细胞结构的完整性[4，10]。脂氧合酶（LOX）广泛存在于高等植物体内，与植物的生长发育与衰老、脂质过氧化作用、光合作用及其他胁迫反应等有关。LOX以亚油酸、亚麻酸等多元不饱和脂肪酸为底物，导致膜脂过氧化反应，生成氢过氧化物，从而破坏膜的完整性[11]。可见，酶促清除系统对于ROS的代谢平衡至关重要。因此，笔者提出假说，认为甘薯采后贮藏能力与甘薯的抗氧化性能密切相关。本试验主要以11种不同耐贮性的甘薯品种为研究对象，探究不同耐贮性甘薯的抗氧化酶活性和活性氧含量，分析不同甘薯品种抗氧化系统与甘薯贮藏性能的关系，以期为甘薯的贮藏保鲜和耐贮甘薯品种的筛选提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2018—2019年在合肥工业大学植物采后贮藏生理研究所进行，甘薯[Ipomoea batatas （L.）Lam.]品种南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18、徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯的扦插茎由国家甘薯改良中心提供，其中南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18耐贮，徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯不耐贮。取倒二叶至倒五叶无病害、无机械损伤的甘薯叶片组织，立即将每个品种的叶片用液氮预冷后研磨成粉末，储存在-80 ℃冰箱中备用。
1.2 SOD活性的测定
采用氮蓝四唑（NBT）法[12]测定SOD的活性：取0.5 g甘薯叶片样品，加入1 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS）冰浴研磨成匀浆，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清即为粗酶液。反应体系为5 mL，取上述粗酶液，加入50 mmol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液[含有130 mmol/L蛋氨酸、0.75 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠]、0.02 mmol/L核黄素，最后加入维生素B2，立刻混匀，用均匀的灯光照射10 min，迅速测定反应液在560 nm处的吸光度。
1.3 POD活性的测定
采用愈创木酚法[13]测定POD活性，粗酶液的提取方法同SOD，反应体系为3 mL，测定时取 100 μL 粗酶液，加入50 mmol/L pH值为6.0的磷酸缓冲液，含有0.25%愈创木酚和3% H2O2，混匀后在470 nm处测定吸光度。 1.4 CAT活性的测定
CAT活性的测定参照文献[14]，反应体系为 1 mL，粗酶液提取方法同SOD，取150 μL粗酶液，加入50mmol/L pH值为7.0的磷酸缓冲液及3%H2O2。用紫外分光光度计测定240 nm处吸光度。
1.5 APX活性的测定
APX活性的测定参考白友强等的方法[15]，测定时反应体系为3 mL，其中含有2.5 mL pH值为7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液、0.1 mL 15 mmol/L抗坏血酸、0.2 mL 15 mmol/L H2O2、0.2 mL粗酶液，在290 nm处测定吸光度。
1.6 过氧化氢含量的测定
参考Hu等的方法[16]，具体步骤如下：称取0.5 g甘薯叶片放入添加有液氮的研钵中迅速研磨成粉末，加入5 mL预冷的提取液（丙酮），继续研磨至匀浆状态，12 000 r/min离心10 min（4 ℃），吸取1 mL上清液转移到新的离心管中，加入0.1 mL 5%硫酸化钛，上下颠倒混匀，常温静置5 min使其充分反应，反应结束后离心，弃去上清液，留取沉淀，加入 2 mL 2 mol/L硫酸充分溶解沉淀，此时溶液呈浅黄色，利用酶标仪在412 nm处测定吸光度。同时，用标准过氧化氢制作标准曲线，根据标准曲线可计算出样品中的过氧化氢浓度。
1.7 超氧阴离子含量的测定
O-2·的检测参照Wang等的方法[17]：取 0.3 g 甘薯叶片样品，加液氮研磨，再加入3 mL 0.1 mol/L、pH值为7.8的磷酸缓冲液再次研磨后使用低温离心机于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清即为超氧根阴离子测定液。测定时每个样品分为2组（空白对照组和测定组），取1 mL上清液与1 mL提取用的磷酸缓冲液、1 mL 1 mmol/L盐酸羟胺加入2组试管中混匀，于25 ℃水浴加热1 h，然后分别加入1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸、1 mL 7 mmol/L α-萘胺，摇匀后于25 ℃水浴20 min，再于530 nm处测定吸光度。在同样的条件下制定标准曲线，根据标准曲线的结果，计算出样品中超氧根阴离子的含量。
1.8 LOX活性的测定
LOX的测定参考Lara等的方法[18]：取0.5 g分装好的甘薯叶片，加入液氮快速研磨，加入5 mL 0.1 mol/L、pH值为6.8磷酸缓冲液[含有4% 交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、1% Triton X-100]，快速研磨成匀浆后，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液即为LOX粗酶液。测定时反应混合物中有浓度为0.1 mol/L、pH值为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液和0.01 mol/L的亚油酸钠，于30 ℃水浴保温10 min后加入粗酶液，混匀后反应15 s开始记录234 nm处的吸光度，以后每隔30 s记录1次。
1.9 丙二醛含量的测定
采用硫代巴比妥酸法[19]检测甘薯叶片组织中的MDA含量。MDA可以与硫代巴比妥酸在酸性条件下发生颜色反应，因此可以利用分光光度法进行测量。将提取液离心后取上清，加入0.5%硫代巴比妥酸（TBA），混匀后在沸水浴中充分反应15 min。离心，吸取上清液加入96孔酶标板内，分别在450、532、600 nm处测定其吸光度。
1.10 数据处理及分析方法
利用基迪奥网站（https：//www.omicshare.com/）进行相关性、热图和主成分（PCA）分析。
2 結果与分析
2.1 11种不同品种甘薯的表观及贮藏特性
甘薯块根含水量高，生理活动旺盛，不易长时间贮藏。贮藏适温为9～15 ℃，空气相对温度为80%～90%，一般可贮藏5～6个月。低于9 ℃时易使甘薯遭遇冷害，高于15 ℃时则会加速甘薯脱水。
种质薯块收获后在温度10～15 ℃、湿度80%～90%的甘薯中贮藏，不作任何保鲜处理，贮藏6个月后调查，观察并记录薯块的腐烂程度和贮藏前、贮藏后的质量并进行分级。所有样品均在3个生物重复中制备，11个甘薯品种的贮藏特性见表1。
2.2 甘薯中SOD、POD、CAT、APX活性的分析
为了探究不同甘薯品种的贮藏特性是否与其抗氧化酶活性相关，笔者检测了不同甘薯品种叶片的抗氧化酶差异。由图1可以看出，耐贮藏甘薯品种南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18的SOD活性较高，其中南瑞苕的SOD活性最高;不耐贮藏甘薯品种徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯的SOD活性整体上低于耐贮藏甘薯品种，其中满村香的SOD活性最低。POD是植物体内清除过氧化氢的主要氧化还原酶。如图1-B所示，POD活性与SOD活性相似，耐贮藏甘薯品种的POD活性总体明显高于不耐贮藏甘薯品种，其中南瑞苕的POD活性最高 徐55-2次之 不耐贮藏甘薯品种中金吊薯的POD活性最高，但其POD活性仍低于耐贮藏甘薯品种中的任意一种。CAT能够催化H2O2分解为O2、H2O2，从而减少植物体内H2O2的积累，减少细胞受到的H2O2损害。图1-C为不同甘薯品种的CAT活性，可以看出，耐贮藏甘薯品种的CAT活性整体上高于不耐贮藏甘薯品种，其中奥墨红的CAT活性最高，大红花的CAT活性最低。APX是植物体内抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原途径的重要抗氧化酶之一，是清除H2O2的关键酶。从图1-D可以看出，5个耐贮藏甘薯品种的APX活性高于6个不耐贮藏甘薯品种，其中南瑞苕酶活性最高，徐薯23的酶活性最低。总之，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯品种的抗氧化酶活性较高，有利于清除活性氧。
2.3 甘薯中ROS含量的分析
在贮藏过程中，甘薯细胞内的代谢平衡被破坏，有1%～2%的O2会形成ROS，而ROS的积累会对细胞产生损伤。ROS主要包括超氧根阴离子自由基（O-2·），而O-2·又可以转变成H2O2、羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）等。因此，O-2·、H2O2代谢是衡量果实贮藏性能的重要指标。如图2-A所示，耐贮藏甘薯品种间O-2·的产生速率差异不明显，且整体低于不耐贮藏甘薯品种，大红花产生O-2·的速率最高;由图2-B可以看出，耐贮藏甘薯品种间H2O2含量差异不大，不耐贮藏甘薯品种中大红花的H2O2含量最高，且不耐贮藏甘薯品种的整体H2O2含量高于耐贮藏甘薯品种。上述结果表明，与耐贮藏甘薯品种相比，不耐贮藏甘薯品种中H2O2与O-2·含量增加。 2.4 甘薯中LOX、MDA含量的分析
如图3-A所示，与抗氧化酶相反，耐贮藏甘薯品种的LOX活性整体上低于不耐贮藏甘薯品种。MDA可以使细胞膜脂过氧化，从而造成细胞氧化损伤，图3-B展示了11种不同品种甘薯叶片的MDA含量，可见耐贮藏甘薯品种的MDA含量整体上低于不耐贮藏甘薯品种，其中徐55-2的MDA含量最低，大红花的MDA含量最高，金吊薯次之。由此可见，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯LOX活性较低，膜脂过氧化产物MDA含量较低，有利于防止不饱和脂肪酸的氧化，防止膜脂过氧化。
2.5 甘薯各生理指标的热图分析
热图分析能发现抗氧化酶与活性氧的变化规律和内在联系以及它们之间可能存在的相互协同与拮抗作用。从图4可以看出，耐贮藏甘薯品种南瑞苕、奥墨红、徐薯55-2、新大紫、徐薯18的抗氧化酶SOD、POD、APX、CAT活性与LOX活性、丙二醛含量、过氧化氢含量、超氧阴离子产生速率相互拮抗，抗氧化酶活性相对较高，活性氧含量相对较低;不耐贮藏甘薯品种徐薯 32、金吊薯、南瓜薯、万二、满村香、大红花的抗氧化酶活性与活性氧含量也明显拮抗。耐贮藏甘薯品种中含有较高的抗氧化酶活性水平，而有较低的活性氧含量。与此相反的是，不耐贮藏甘薯品种中活性氧含量较高，抗氧化酶活性较低。
2.6 主成分分析
由图5可以看出，PC1、PC2分别揭示了数据的85.3%、7.7%可变性。根据上述测量参数，在PC1中耐贮藏甘薯品种和不耐贮藏甘薯品种之间存在明显聚类。此外，在PC1方向上显示，最高正负荷值的甘薯品种是金吊薯，PC2上的南瑞苕表现出最低的负荷值，表明其与贮藏性能的相关性。因此可以认为，这些抗氧化物质对耐贮性甘薯的贮藏性能贡献很大，抗氧化能力和贮藏性能之间的正相关性在具有不同耐贮性的甘薯品种中可能是普遍的。
2.7 甘薯抗氧化酶与贮藏性的相关性分析
通过对甘薯各生理指标间的相关性进行分析，可以了解它们之间存在的内在联系。由图6可以看出，11个品种甘薯叶片中SOD活性与POD、CAT、APX活性有着较高的正相关系数，分布在 0.79～0.93之间;与LOX活性、H2O2含量、O-2·产生速率、MDA含量呈明显负相关，相关系数分布在 -0.87～-0.91之间，表明抗氧化酶活性之间呈明显正相关，而与活性氧含量呈明显负相关。
3 讨论
成熟和衰老会导致植物果实中的ROS积累和抗氧化活性的变化，例如番茄、甘薯要清除自身产生的活性氧，通常是由酶类抗氧化物质和非酶促抗氧化物质来完成的[20]。在甘薯采后的贮藏期间，一般通过抗氧化酶清除O-2·和H2O2，SOD、CAT、APX和POD都能够分解甘薯衰老中产生的H2O2、·OH 等ROS代谢产物，进而保护植物组织免受ROS产生的伤害[21]。甘薯在低温存储过程中容易受到冷害，在抗寒胁迫下，抗氧化酶活性在储存早期迅速增强，此后由于ROS清除酶活性逐渐丢失，ROS代谢产物含量急剧增加[22-23]。
本研究比较了不同耐贮性的甘薯的抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）、脂氧合酶（LOX）、活性氧（H2O2、O-2·）和丙二醛含量，发现耐贮藏甘薯品種中抗氧化酶活性相对较高，能够减少自由基积累、维持细胞ROS的代谢平衡、提高其抵抗逆境的能力，从而延长了甘薯采后的贮藏期;同时，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯品种中活性氧、MDA含量以及脂氧合酶LOX活性较低，相对减小了活性氧对细胞的损伤，减轻了细胞膜脂的过氧化作用，提高了甘薯的抗病性，从而延长了甘薯的贮藏期。耐贮藏甘薯品种和不耐贮藏甘薯品种在PCA分布上具有特征性，可通过主成分分析进行区分和识别。相关性分析结果表明，11种采后甘薯叶片抗氧化酶活性之间呈明显正相关，而与活性氧含量、MDA含量、LOX活性呈明显负相关。热图结果显示，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯的抗氧化酶活性较高，脂氧合酶活性较低，活性氧及MDA含量较低，不耐贮藏甘薯品种活性氧含量相对较高，抗氧化酶活性相对较低。本研究结果可为耐贮甘薯的品种选育及应用提供一定的参考，为不同耐贮性甘薯产品的开发与利用提供相关参考依据。
参考文献：
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关键词：甘薯;贮藏;活性氧自由基;抗氧化酶;相关性分析
中图分类号： S531.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0162-06
甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]属旋花科甘薯属，富含维生素、矿物质、膳食纤维、必需脂肪酸及抗氧化剂等[1]。甘薯是重要的低投入、高产出、耐干旱、耐脊薄、多用途的粮食、饲料及工业原料作物和新型的生物能源作物[2]。甘薯主要以块根为利用对象，因其体积大、含水量高，在运输和贮藏过程中的损失严重，从而限制了甘薯产业的发展。
影响甘薯种薯贮藏的主要因素有薯块自身的生理变化、病菌侵染和贮藏环境条件等[3]。呼吸作用可造成植物细胞内活性氧（reactive oxygen species，简称ROS）的产生和积累，而植物体内的活性氧主要以自由基、非自由基形式存在，ROS主要包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟基自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、脂质过氧化物和单线态氧[4]。ROS通常被认为是有氧代谢的副产物，其产生的主要部位是线粒体和叶绿体中的电子传递链。当电子传递到氧（O2）时，就会产生ROS，而且逆境胁迫会加剧ROS的积累[5]。ROS介导的氧化应激可对植物细胞造成氧化胁迫，使其呈现多种有害的细胞学效应，如生物膜过氧化、细胞核受损、氨基酸氧化、蛋白质变性、DNA链断裂、色素破坏、光合作用受阻、呼吸作用异常、酶失活及植物生长素IAA分解等[6-7]。抗氧化酶系主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）等[8-9]，可以将体内形成的过氧化物转换为毒害较低或无害的物质。在正常条件下，植物细胞中产生的ROS可通过体内抗氧化酶介导的酶促反应清除系统维持在相对稳定的水平。抗氧化酶可以清除活性氧及氧化中间体，在果实采后贮藏过程中起着重要作用，这种平衡可能也会因抗氧化酶的消耗或ROS的过量积累而被打断，导致氧化应激，从而对细胞大分子和生物膜造成损害并促进脂质过氧化。膜脂过氧化的产物丙二醛（MDA）可以使细胞膜上的蛋白发生氧化并交联，导致蛋白失活，形成细胞膜空隙，进一步破坏细胞结构的完整性[4，10]。脂氧合酶（LOX）广泛存在于高等植物体内，与植物的生长发育与衰老、脂质过氧化作用、光合作用及其他胁迫反应等有关。LOX以亚油酸、亚麻酸等多元不饱和脂肪酸为底物，导致膜脂过氧化反应，生成氢过氧化物，从而破坏膜的完整性[11]。可见，酶促清除系统对于ROS的代谢平衡至关重要。因此，笔者提出假说，认为甘薯采后贮藏能力与甘薯的抗氧化性能密切相关。本试验主要以11种不同耐贮性的甘薯品种为研究对象，探究不同耐贮性甘薯的抗氧化酶活性和活性氧含量，分析不同甘薯品种抗氧化系统与甘薯贮藏性能的关系，以期为甘薯的贮藏保鲜和耐贮甘薯品种的筛选提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2018—2019年在合肥工业大学植物采后贮藏生理研究所进行，甘薯[Ipomoea batatas （L.）Lam.]品种南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18、徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯的扦插茎由国家甘薯改良中心提供，其中南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18耐贮，徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯不耐贮。取倒二叶至倒五叶无病害、无机械损伤的甘薯叶片组织，立即将每个品种的叶片用液氮预冷后研磨成粉末，储存在-80 ℃冰箱中备用。
1.2 SOD活性的测定
采用氮蓝四唑（NBT）法[12]测定SOD的活性：取0.5 g甘薯叶片样品，加入1 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS）冰浴研磨成匀浆，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清即为粗酶液。反应体系为5 mL，取上述粗酶液，加入50 mmol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液[含有130 mmol/L蛋氨酸、0.75 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠]、0.02 mmol/L核黄素，最后加入维生素B2，立刻混匀，用均匀的灯光照射10 min，迅速测定反应液在560 nm处的吸光度。
1.3 POD活性的测定
采用愈创木酚法[13]测定POD活性，粗酶液的提取方法同SOD，反应体系为3 mL，测定时取 100 μL 粗酶液，加入50 mmol/L pH值为6.0的磷酸缓冲液，含有0.25%愈创木酚和3% H2O2，混匀后在470 nm处测定吸光度。 1.4 CAT活性的测定
CAT活性的测定参照文献[14]，反应体系为 1 mL，粗酶液提取方法同SOD，取150 μL粗酶液，加入50mmol/L pH值为7.0的磷酸缓冲液及3%H2O2。用紫外分光光度计测定240 nm处吸光度。
1.5 APX活性的测定
APX活性的测定参考白友强等的方法[15]，测定时反应体系为3 mL，其中含有2.5 mL pH值为7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液、0.1 mL 15 mmol/L抗坏血酸、0.2 mL 15 mmol/L H2O2、0.2 mL粗酶液，在290 nm处测定吸光度。
1.6 过氧化氢含量的测定
参考Hu等的方法[16]，具体步骤如下：称取0.5 g甘薯叶片放入添加有液氮的研钵中迅速研磨成粉末，加入5 mL预冷的提取液（丙酮），继续研磨至匀浆状态，12 000 r/min离心10 min（4 ℃），吸取1 mL上清液转移到新的离心管中，加入0.1 mL 5%硫酸化钛，上下颠倒混匀，常温静置5 min使其充分反应，反应结束后离心，弃去上清液，留取沉淀，加入 2 mL 2 mol/L硫酸充分溶解沉淀，此时溶液呈浅黄色，利用酶标仪在412 nm处测定吸光度。同时，用标准过氧化氢制作标准曲线，根据标准曲线可计算出样品中的过氧化氢浓度。
1.7 超氧阴离子含量的测定
O-2·的检测参照Wang等的方法[17]：取 0.3 g 甘薯叶片样品，加液氮研磨，再加入3 mL 0.1 mol/L、pH值为7.8的磷酸缓冲液再次研磨后使用低温离心机于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清即为超氧根阴离子测定液。测定时每个样品分为2组（空白对照组和测定组），取1 mL上清液与1 mL提取用的磷酸缓冲液、1 mL 1 mmol/L盐酸羟胺加入2组试管中混匀，于25 ℃水浴加热1 h，然后分别加入1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸、1 mL 7 mmol/L α-萘胺，摇匀后于25 ℃水浴20 min，再于530 nm处测定吸光度。在同样的条件下制定标准曲线，根据标准曲线的结果，计算出样品中超氧根阴离子的含量。
1.8 LOX活性的测定
LOX的测定参考Lara等的方法[18]：取0.5 g分装好的甘薯叶片，加入液氮快速研磨，加入5 mL 0.1 mol/L、pH值为6.8磷酸缓冲液[含有4% 交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、1% Triton X-100]，快速研磨成匀浆后，于4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液即为LOX粗酶液。测定时反应混合物中有浓度为0.1 mol/L、pH值为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液和0.01 mol/L的亚油酸钠，于30 ℃水浴保温10 min后加入粗酶液，混匀后反应15 s开始记录234 nm处的吸光度，以后每隔30 s记录1次。
1.9 丙二醛含量的测定
采用硫代巴比妥酸法[19]检测甘薯叶片组织中的MDA含量。MDA可以与硫代巴比妥酸在酸性条件下发生颜色反应，因此可以利用分光光度法进行测量。将提取液离心后取上清，加入0.5%硫代巴比妥酸（TBA），混匀后在沸水浴中充分反应15 min。离心，吸取上清液加入96孔酶标板内，分别在450、532、600 nm处测定其吸光度。
1.10 数据处理及分析方法
利用基迪奥网站（https：//www.omicshare.com/）进行相关性、热图和主成分（PCA）分析。
2 結果与分析
2.1 11种不同品种甘薯的表观及贮藏特性
甘薯块根含水量高，生理活动旺盛，不易长时间贮藏。贮藏适温为9～15 ℃，空气相对温度为80%～90%，一般可贮藏5～6个月。低于9 ℃时易使甘薯遭遇冷害，高于15 ℃时则会加速甘薯脱水。
种质薯块收获后在温度10～15 ℃、湿度80%～90%的甘薯中贮藏，不作任何保鲜处理，贮藏6个月后调查，观察并记录薯块的腐烂程度和贮藏前、贮藏后的质量并进行分级。所有样品均在3个生物重复中制备，11个甘薯品种的贮藏特性见表1。
2.2 甘薯中SOD、POD、CAT、APX活性的分析
为了探究不同甘薯品种的贮藏特性是否与其抗氧化酶活性相关，笔者检测了不同甘薯品种叶片的抗氧化酶差异。由图1可以看出，耐贮藏甘薯品种南瑞苕、奥墨红、徐55-2、新大紫、徐薯18的SOD活性较高，其中南瑞苕的SOD活性最高;不耐贮藏甘薯品种徐薯23、大红花、南瓜薯、满村香、万二、金吊薯的SOD活性整体上低于耐贮藏甘薯品种，其中满村香的SOD活性最低。POD是植物体内清除过氧化氢的主要氧化还原酶。如图1-B所示，POD活性与SOD活性相似，耐贮藏甘薯品种的POD活性总体明显高于不耐贮藏甘薯品种，其中南瑞苕的POD活性最高 徐55-2次之 不耐贮藏甘薯品种中金吊薯的POD活性最高，但其POD活性仍低于耐贮藏甘薯品种中的任意一种。CAT能够催化H2O2分解为O2、H2O2，从而减少植物体内H2O2的积累，减少细胞受到的H2O2损害。图1-C为不同甘薯品种的CAT活性，可以看出，耐贮藏甘薯品种的CAT活性整体上高于不耐贮藏甘薯品种，其中奥墨红的CAT活性最高，大红花的CAT活性最低。APX是植物体内抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原途径的重要抗氧化酶之一，是清除H2O2的关键酶。从图1-D可以看出，5个耐贮藏甘薯品种的APX活性高于6个不耐贮藏甘薯品种，其中南瑞苕酶活性最高，徐薯23的酶活性最低。总之，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯品种的抗氧化酶活性较高，有利于清除活性氧。
2.3 甘薯中ROS含量的分析
在贮藏过程中，甘薯细胞内的代谢平衡被破坏，有1%～2%的O2会形成ROS，而ROS的积累会对细胞产生损伤。ROS主要包括超氧根阴离子自由基（O-2·），而O-2·又可以转变成H2O2、羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）等。因此，O-2·、H2O2代谢是衡量果实贮藏性能的重要指标。如图2-A所示，耐贮藏甘薯品种间O-2·的产生速率差异不明显，且整体低于不耐贮藏甘薯品种，大红花产生O-2·的速率最高;由图2-B可以看出，耐贮藏甘薯品种间H2O2含量差异不大，不耐贮藏甘薯品种中大红花的H2O2含量最高，且不耐贮藏甘薯品种的整体H2O2含量高于耐贮藏甘薯品种。上述结果表明，与耐贮藏甘薯品种相比，不耐贮藏甘薯品种中H2O2与O-2·含量增加。 2.4 甘薯中LOX、MDA含量的分析
如图3-A所示，与抗氧化酶相反，耐贮藏甘薯品种的LOX活性整体上低于不耐贮藏甘薯品种。MDA可以使细胞膜脂过氧化，从而造成细胞氧化损伤，图3-B展示了11种不同品种甘薯叶片的MDA含量，可见耐贮藏甘薯品种的MDA含量整体上低于不耐贮藏甘薯品种，其中徐55-2的MDA含量最低，大红花的MDA含量最高，金吊薯次之。由此可见，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯LOX活性较低，膜脂过氧化产物MDA含量较低，有利于防止不饱和脂肪酸的氧化，防止膜脂过氧化。
2.5 甘薯各生理指标的热图分析
热图分析能发现抗氧化酶与活性氧的变化规律和内在联系以及它们之间可能存在的相互协同与拮抗作用。从图4可以看出，耐贮藏甘薯品种南瑞苕、奥墨红、徐薯55-2、新大紫、徐薯18的抗氧化酶SOD、POD、APX、CAT活性与LOX活性、丙二醛含量、过氧化氢含量、超氧阴离子产生速率相互拮抗，抗氧化酶活性相对较高，活性氧含量相对较低;不耐贮藏甘薯品种徐薯 32、金吊薯、南瓜薯、万二、满村香、大红花的抗氧化酶活性与活性氧含量也明显拮抗。耐贮藏甘薯品种中含有较高的抗氧化酶活性水平，而有较低的活性氧含量。与此相反的是，不耐贮藏甘薯品种中活性氧含量较高，抗氧化酶活性较低。
2.6 主成分分析
由图5可以看出，PC1、PC2分别揭示了数据的85.3%、7.7%可变性。根据上述测量参数，在PC1中耐贮藏甘薯品种和不耐贮藏甘薯品种之间存在明显聚类。此外，在PC1方向上显示，最高正负荷值的甘薯品种是金吊薯，PC2上的南瑞苕表现出最低的负荷值，表明其与贮藏性能的相关性。因此可以认为，这些抗氧化物质对耐贮性甘薯的贮藏性能贡献很大，抗氧化能力和贮藏性能之间的正相关性在具有不同耐贮性的甘薯品种中可能是普遍的。
2.7 甘薯抗氧化酶与贮藏性的相关性分析
通过对甘薯各生理指标间的相关性进行分析，可以了解它们之间存在的内在联系。由图6可以看出，11个品种甘薯叶片中SOD活性与POD、CAT、APX活性有着较高的正相关系数，分布在 0.79～0.93之间;与LOX活性、H2O2含量、O-2·产生速率、MDA含量呈明显负相关，相关系数分布在 -0.87～-0.91之间，表明抗氧化酶活性之间呈明显正相关，而与活性氧含量呈明显负相关。
3 讨论
成熟和衰老会导致植物果实中的ROS积累和抗氧化活性的变化，例如番茄、甘薯要清除自身产生的活性氧，通常是由酶类抗氧化物质和非酶促抗氧化物质来完成的[20]。在甘薯采后的贮藏期间，一般通过抗氧化酶清除O-2·和H2O2，SOD、CAT、APX和POD都能够分解甘薯衰老中产生的H2O2、·OH 等ROS代谢产物，进而保护植物组织免受ROS产生的伤害[21]。甘薯在低温存储过程中容易受到冷害，在抗寒胁迫下，抗氧化酶活性在储存早期迅速增强，此后由于ROS清除酶活性逐渐丢失，ROS代谢产物含量急剧增加[22-23]。
本研究比较了不同耐贮性的甘薯的抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）、脂氧合酶（LOX）、活性氧（H2O2、O-2·）和丙二醛含量，发现耐贮藏甘薯品種中抗氧化酶活性相对较高，能够减少自由基积累、维持细胞ROS的代谢平衡、提高其抵抗逆境的能力，从而延长了甘薯采后的贮藏期;同时，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯品种中活性氧、MDA含量以及脂氧合酶LOX活性较低，相对减小了活性氧对细胞的损伤，减轻了细胞膜脂的过氧化作用，提高了甘薯的抗病性，从而延长了甘薯的贮藏期。耐贮藏甘薯品种和不耐贮藏甘薯品种在PCA分布上具有特征性，可通过主成分分析进行区分和识别。相关性分析结果表明，11种采后甘薯叶片抗氧化酶活性之间呈明显正相关，而与活性氧含量、MDA含量、LOX活性呈明显负相关。热图结果显示，与不耐贮藏甘薯品种相比，耐贮藏甘薯的抗氧化酶活性较高，脂氧合酶活性较低，活性氧及MDA含量较低，不耐贮藏甘薯品种活性氧含量相对较高，抗氧化酶活性相对较低。本研究结果可为耐贮甘薯的品种选育及应用提供一定的参考，为不同耐贮性甘薯产品的开发与利用提供相关参考依据。
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