【摘 要】
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[目的]建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法.[方法]扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性.以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,
【机 构】
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贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病预防控制中心,贵阳550008;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳550025
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[目的]建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法.[方法]扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性.以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本.[结果]通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好.ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0 μg/100 μL,血清稀释度为1:300,3％BSA封闭1 h为最佳反应条件,临界值为2.738.本试验建立的间接ELISA方法批内和批间变异系数均＜10％,证明该方法具有良好的重复性;对绵羊肺炎支原体(Mo)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口蹄疫病毒(FMDV)、弓形虫及山羊痘病毒(GPV)标准阳性血清的检测均为阴性,表明该方法特异性较强;184份临床血清临床应用结果显示,该方法与正向间接血凝诊断试剂盒检测结果阳性符合率为93.33％,阴性符合率为75.23％,两者相对符合率为82.61％.[结论]本研究成功建立了Mmc LPPA蛋白间接ELISA抗体检测方法,为临床Mmc血清抗体水平的监测及Mmc血清流行病学调查奠定了基础.
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