【目的】明确当前云南省部分烟草种植区根结线虫的种类和分布,为烟草根结线虫病综合防治及烟草品种布局提供理论依据。【方法】2015年8~10月,在云南省主要烟草种植区昆明、曲靖和玉溪市采集54份烟草根结线虫病根样本,采用雌成虫会阴花纹形态观察及分子生物学检测(r DNA-ITS区和SCAR特异性鉴定)对病原根结线虫种类进行鉴定。【结果】采集的54份样本中有24份样本的病原为花生根结线虫(Meloidogyne arenaria),占44.44%;7份样本为南方根结线虫(M.incognita),占12.96%;1份样本为爪哇根结线虫(M.javanica),占1.85%;11份样本为爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群,占20.37%;5份样本为南方根结线虫和花生根结线虫的复合种群,占9.26%;3份样本为南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群,占5.56%;3份样本为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群,占5.56%。【结论】当前危害云南省部分烟草种植区(昆明、曲靖和玉溪烟区)的根结线虫种类主要有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种,以花生根结线虫为优势种群。