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免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应的一个实验。以成为病理诊断不可或缺的重要手段，随着试剂盒的不断优化，正确率也在不断提高。但免疫组化实验过程步骤繁多，稍不注意容易影响结果。本人谈谈工作中发现的注意事项。
1、切片：3-4微米
免疫组化实验是一个以抗原抗体反应为基础的实验项目。所以抗原的多少直接影响实验的质量。所以石蜡切片的厚度为3～4微米较好，过厚，石蜡切片在修复时容易掉片，过薄，影响目的部位的表达，不利于诊断。
2、载玻片：硅化玻片
石蜡切片贴在载玻片上进行免疫组化染色，由于染色过程操作步骤及洗片次数较多，容易出现脱片现象，所以，用硅化玻片承载蜡片。
3、烤片：温度60℃～65℃、时间2～4小时
为什么要选择60℃～65℃呢？因为病理科常用的石蜡多为硬蜡。其熔点在60℃左右。组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度一般设置为65℃左右。
为什么时间是2～4小时呢？其实，切片在60℃～65℃的烤箱内烤2～24小时，对抗原的表达没有影响。只是这个时间比较适合本科的工作。
值得一提的是，烤片后的切片应尽快进行染色。如果切片迟迟不染，存放于室温中或工作冰箱中，切片内的抗原会随着时间的延长而慢慢消失，甚至出现假阴性。原则上是，现切片，现做片，一气呵成。
4、脱蜡：试剂最好用二甲苯。脱蜡时间参考常规HE的脱蜡时间。
石蜡切片上的石蜡不容于水，影响组织内的抗原与抗体的结合，所以要用脱蜡剂把石蜡清除掉。现在市场上有多种脱蜡剂，但效果最好的是二甲苯。二甲苯有毒，所以脱蜡时最好在通风较好的地方进行。
脱蜡的时间要根据脱蜡剂的使用次数和现场的温度而作调整。脱蜡剂新鲜，室内温度较高，脱蜡时间大概为10分钟左右。反之，脱蜡剂陈旧，室内温度低，脱蜡时间大概在20分钟左右。也可以参考常规HE切片的时间来调整脱蜡时间。
洗掉石蜡后的切片不能直接至于水中。因为二甲苯不容于水，它粘附于玻片上影响抗原与抗体的结合、增加或产生背景染色。所以要用酒精洗掉玻片上的二甲苯。如何判断二甲苯已经被清洗干净呢？在酒精中抽取几张片子，观察酒精的流动情况，没有组织的地方不挂小水珠。然后，把切片置于蒸馏水中，观察水是否发白，是否有油状物漂在水面，如果有，说明切片表面的二甲苯没有洗干净，应该重置于无水酒精内浸泡或更换新的无水酒精再浸泡。直到切片置于蒸馏水中数秒再拿起，没有组织的地方不挂小水珠。此时脱蜡完成。
5、抗原修复：此处仅讨论高温高压修复，因此法适用范围较广。
高压锅加热抗原修复液（柠檬酸或EDTA）至沸腾，放入切片，切片全浸泡在修复液内，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，呈上下跳动样。这种状态持续3分钟，停止加热让其自然冷却20分钟。
实际工作中，我们常缩短这一步的时间。但有一点要注意，修复完毕后不能立刻用人为是方法降温，要保持高压锅内部高压沸腾的状态几分钟（本人工作中放5分钟）后，才实行人为降温。因为大多数的抗原在高温高压的情况下3分钟可以完全把抗原暴露，但，有一些抗原的要求比较高，需要更长一点的时间才能把抗原完全打开。
6、除去内源性过氧化物酶：0.3%的过氧化氢水溶液
身体各组织内都含有过氧化物酶，尤其在红细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、出血组织、坏死组织中含量较多。内源性过氧化物酶与辣根过氧化物酶一样，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，影响病理医生的诊断。因此，在显色前需除去。此操作可以在修复前、加一抗前或加二抗前进行。
除去内源性过氧化物酶常用0.3%的过氧化氢水溶液浸泡10分钟或用0.3%的过氧化氢甲醇水溶液。甲醇对各种酶都有钝化的作用，但它有一定的毒性，所以使用时要注意通风
7、检查所有化学试剂的PH值：PH试纸
常用的洗液为PH7.6的PBS缓冲液。防止用错试剂或试剂放置过久导致的PH值的改变的情况出现，建议使用PH试纸条测试洗液的PH值。
8、加抗体：要混匀
加抗体前把切片上的洗液尽量擦干，因为切片上的洗液会稀释抗体的浓度。滴加抗体后要在组织上混匀一下，因为1、组织表面的液体有张力，2、切片上的洗液不是均匀分布的。混匀后，破坏了切片表面的水化膜，也让切片上的抗体浓度一致。
抗体的覆盖范围应该不边缘多2MM。因为在孵育的过程中，抗体会有少量的蒸发，容易形成边缘效应。所以抗体覆盖面积要比切片组织面积大。
9、DAB显色
DAB的显色时间已镜下观察为佳，一些标记细胞浆和细胞膜的组织一旦发生反应，肉眼就能判断。细胞核和不反应的组织参考说明书的推荐时间。显色完毕后要充分洗干净切片表面的显色液，防止本底增高和假阳性的现象出现。
10、一张好的片子，脱水透明很重要。
透明清晰的片子有利于病理医生的诊断，所以此处建議在无水酒精脱水后把切片浸泡于石碳酸二甲苯中。石碳酸二甲苯对水分的吸附性强，防止空气中的水分粘附于切片而影响二甲苯的透明。
制片的质量影响病理医生的诊断，影响病人的预后。正确的操作是实验的基础，细节是实验成败的关键，因此，我们要认真对待制片的每个环节，使实验更稳定，更准确。
1、切片：3-4微米
免疫组化实验是一个以抗原抗体反应为基础的实验项目。所以抗原的多少直接影响实验的质量。所以石蜡切片的厚度为3～4微米较好，过厚，石蜡切片在修复时容易掉片，过薄，影响目的部位的表达，不利于诊断。
2、载玻片：硅化玻片
石蜡切片贴在载玻片上进行免疫组化染色，由于染色过程操作步骤及洗片次数较多，容易出现脱片现象，所以，用硅化玻片承载蜡片。
3、烤片：温度60℃～65℃、时间2～4小时
为什么要选择60℃～65℃呢？因为病理科常用的石蜡多为硬蜡。其熔点在60℃左右。组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度一般设置为65℃左右。
为什么时间是2～4小时呢？其实，切片在60℃～65℃的烤箱内烤2～24小时，对抗原的表达没有影响。只是这个时间比较适合本科的工作。
值得一提的是，烤片后的切片应尽快进行染色。如果切片迟迟不染，存放于室温中或工作冰箱中，切片内的抗原会随着时间的延长而慢慢消失，甚至出现假阴性。原则上是，现切片，现做片，一气呵成。
4、脱蜡：试剂最好用二甲苯。脱蜡时间参考常规HE的脱蜡时间。
石蜡切片上的石蜡不容于水，影响组织内的抗原与抗体的结合，所以要用脱蜡剂把石蜡清除掉。现在市场上有多种脱蜡剂，但效果最好的是二甲苯。二甲苯有毒，所以脱蜡时最好在通风较好的地方进行。
脱蜡的时间要根据脱蜡剂的使用次数和现场的温度而作调整。脱蜡剂新鲜，室内温度较高，脱蜡时间大概为10分钟左右。反之，脱蜡剂陈旧，室内温度低，脱蜡时间大概在20分钟左右。也可以参考常规HE切片的时间来调整脱蜡时间。
洗掉石蜡后的切片不能直接至于水中。因为二甲苯不容于水，它粘附于玻片上影响抗原与抗体的结合、增加或产生背景染色。所以要用酒精洗掉玻片上的二甲苯。如何判断二甲苯已经被清洗干净呢？在酒精中抽取几张片子，观察酒精的流动情况，没有组织的地方不挂小水珠。然后，把切片置于蒸馏水中，观察水是否发白，是否有油状物漂在水面，如果有，说明切片表面的二甲苯没有洗干净，应该重置于无水酒精内浸泡或更换新的无水酒精再浸泡。直到切片置于蒸馏水中数秒再拿起，没有组织的地方不挂小水珠。此时脱蜡完成。
5、抗原修复：此处仅讨论高温高压修复，因此法适用范围较广。
高压锅加热抗原修复液（柠檬酸或EDTA）至沸腾，放入切片，切片全浸泡在修复液内，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，呈上下跳动样。这种状态持续3分钟，停止加热让其自然冷却20分钟。
实际工作中，我们常缩短这一步的时间。但有一点要注意，修复完毕后不能立刻用人为是方法降温，要保持高压锅内部高压沸腾的状态几分钟（本人工作中放5分钟）后，才实行人为降温。因为大多数的抗原在高温高压的情况下3分钟可以完全把抗原暴露，但，有一些抗原的要求比较高，需要更长一点的时间才能把抗原完全打开。
6、除去内源性过氧化物酶：0.3%的过氧化氢水溶液
身体各组织内都含有过氧化物酶，尤其在红细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、出血组织、坏死组织中含量较多。内源性过氧化物酶与辣根过氧化物酶一样，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，影响病理医生的诊断。因此，在显色前需除去。此操作可以在修复前、加一抗前或加二抗前进行。
除去内源性过氧化物酶常用0.3%的过氧化氢水溶液浸泡10分钟或用0.3%的过氧化氢甲醇水溶液。甲醇对各种酶都有钝化的作用，但它有一定的毒性，所以使用时要注意通风
7、检查所有化学试剂的PH值：PH试纸
常用的洗液为PH7.6的PBS缓冲液。防止用错试剂或试剂放置过久导致的PH值的改变的情况出现，建议使用PH试纸条测试洗液的PH值。
8、加抗体：要混匀
加抗体前把切片上的洗液尽量擦干，因为切片上的洗液会稀释抗体的浓度。滴加抗体后要在组织上混匀一下，因为1、组织表面的液体有张力，2、切片上的洗液不是均匀分布的。混匀后，破坏了切片表面的水化膜，也让切片上的抗体浓度一致。
抗体的覆盖范围应该不边缘多2MM。因为在孵育的过程中，抗体会有少量的蒸发，容易形成边缘效应。所以抗体覆盖面积要比切片组织面积大。
9、DAB显色
DAB的显色时间已镜下观察为佳，一些标记细胞浆和细胞膜的组织一旦发生反应，肉眼就能判断。细胞核和不反应的组织参考说明书的推荐时间。显色完毕后要充分洗干净切片表面的显色液，防止本底增高和假阳性的现象出现。
10、一张好的片子，脱水透明很重要。
透明清晰的片子有利于病理医生的诊断，所以此处建議在无水酒精脱水后把切片浸泡于石碳酸二甲苯中。石碳酸二甲苯对水分的吸附性强，防止空气中的水分粘附于切片而影响二甲苯的透明。
制片的质量影响病理医生的诊断，影响病人的预后。正确的操作是实验的基础，细节是实验成败的关键，因此，我们要认真对待制片的每个环节，使实验更稳定，更准确。