目的建立巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CMV CTL）体外扩增的方法。方法用1μg/mL全长巨细胞病毒pp65（CMV pp65）多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞（PBMC）,同时加入白细胞介素2（IL-2）、 IL-15、 IL-21扩增20 d。在培养第7天,加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC,第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3（OKT3）;对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组。采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）的分泌水平进行分析, ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平。结果培养后可以收集得到（165.26±6.14）×10⁶个细胞,其中CD3⁺ T细胞占89.21%, CD8⁺ T细胞占CD3⁺ T细胞的（43.54±28.03）%, CD4⁺ T细胞占CD3⁺ T细胞（34.23±26.18）%。获得的CD3⁺ T细胞以效应记忆性T细胞(T_EM)为主,且扩增培养后的CD8⁺和CD4⁺ T_EM比例较培养前显著增高。另外,培养后干细胞样记忆性T细胞(T_SCM)和组织原位记忆T细胞(T_RM)的比例均较培养前显著增加。在功能实验中,培养后得到的IFN-γ⁺的分泌型CMV特异性CD8⁺ T细胞群比例较扩增前明显增加, TNF-α⁺ CMV特异性CD8⁺ T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4⁺ T细胞群比例与培养前无明显变化。此外,供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关,且在该培养体系下, IFN-γ⁺和TNF-α⁺ CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关。结论本研究成功建立了在体外有效的培养和扩增CMV CTL的方法。