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[摘要] 目的 采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（ HPLC-Q-TOF-MS） 分析利拉萘酯原料中主要杂质并对其结构进行鉴定。方法 色谱柱为Agilent Extend C18（2.1×100 mm，1.8μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，体积流量为0.4m L/min；离子源：ESI 离子源；扫描模式：正离子扫描。结果 根据各降解杂质的二级质谱图以及高分辨数据，利拉萘酯原料中主要存在6 个有关物质，主要来源于原料中间体和降解产物。结论 建立的方法能有效地分离主成分利拉萘酯与有关物质，为利拉萘酯原料药的质量控制、工艺优化及贮存提供参考。
[关键词] 利拉萘酯；有关物质；杂质结构鉴定；超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-36-04
Analysis on major impuritiy in liranaftate based on UPLC-Q-TOF-MS/MS
CHEN Danhong1 GU Yong1 CHEN Wenming2 LONG Hongping2
1.The Fifth Hospital of Jiangyin，Jiangyin 214415，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China
[Abstract] Objective To analyze major impuritiy in liranaftate by ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods Chromatographic column was Agilent Extend C18 （2.1×100 mm，1.8μm） and mobile phase was 0.1% formic acid-water（A）-acetonitrile（B） with gradient elution. Volume flow was 0.4m L/min.Ion source was electrospray ionization （ESI） ion source.Scanning mode was positive ion scanning. Results According to secondary mass spectrum of degradation impurity and high resolution data，liranaftate mainly had 6 related substances which are mainly from raw material intermediate and degradation product.Conclusion The established method can effectively separate principal component liranaftate and related substances， which can provide reference for quality control，technology optimization and storage of liranaftate raw medicine.
[Key words] Liranaftate； Related substances；Structure identification of impuritiy；Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry
利拉萘酯（Liranaftate）是是用于皮肤局部感染的新一代抗真菌药，与目前临床上治疗皮肤真菌感染的药物。抗真菌谱广，对包括须发癣菌在内的皮真菌有强大的抗菌活性，对一些致病酵母菌也有很好的活性[1-5]。高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术集液相色谱的高分离能力与质谱的强结构解析能力于一体，已成为药物杂质分析的有力工具[6-12]。由于利拉萘酯的结构不稳定，本文对利拉萘酯原料中的主要杂质进行了研究，以HPLC-MS 技术为分析手段，对其中6个有关物质进行了UPLC-Q-TOF测定，根据其裂解规律推测其可能的结构，为利拉萘酯的质量控制和工艺优化提供了参考。
1 材料
仪器Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）；MassHunter质谱工作站（美国Agilent公司）；BiofugeprimoR台式离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（美国Millipore公司）；x S105 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。
药品与试剂乙腈（质譜纯，德国Omni公司）；实验室自制超纯水；甲酸（质谱纯，美国Sigma公司）；利拉萘酯原料（湖南中医药大学药化研究实验室合成，批号为20161103）。
2 實验方法
2.1 拉萘酯样品溶液的制备
精密称取约20mg利拉萘酯原料，精密加入5.00mL 50%甲醇，超声提取10min，8000rpm离心10min，取上清液，再用甲醇稀释5倍，0.22μm微孔滤膜滤过，即制得利拉萘酯样品溶液。 2.2 色谱条件和质谱条件
色谱条件：色谱柱Agilent Extend C18（2.1×50mm，1.8μm），流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～8 min，15%～25%B；8～12min，25%～35%B，流速：0.4mL/min，进样量：2μL。
质谱检测条件：离子化方式为电喷雾离子化（ESI），准确质量数用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，正离子分析模式，MRE扫描方式。扫描检测，m/z 100～1500，除溶剂气体为氮气，干燥气温度为325℃；干燥气流速：6.8L/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：4.0kV；Fragment电压110V，扫描范围为100 ～ 1000。
3 实验结果
3.1 UPLC-Q-TOF 法分析利拉萘酯原料的主要杂质
采用Q-TOF/MS技术对利拉萘酯中的主要杂质进行分析。在总离子流图中，利拉萘酯原料药中主要检测出6个杂质，结果见图1。根据LC-MS/MS对利拉萘酯进行分析，得到各有关物质的一级、二级质谱信息（表1）数据，对6个杂质的结构进行解析。
3.2 利拉萘酯有关物质的结构鉴定推测
将利拉萘酯各有关物质与利拉萘酯的一级、二级质谱信息进行对比研究，对各有关的物质结构进行解析，推测其可能的化学结构如下：
3.2.1 有关物质1 时间为4.328min，一级质谱中主要加合离子为m/z 199.2133，同時还有m/z 221.1895，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C8H10N2O2S，其二级质谱主要碎片181.1688[M+H-CH3]， 167.1455[M+H-S]， 110.0528[M+H-OHCSNCH3]，推断出杂质1的结构见图3。
3.2.2 有关物质2 时间为5.196min，一级质谱中主要加合离子为m/z 285.1513，同时还有m/z 307.1657，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C16H16N2O3，其二级质谱主要碎片181.2015，131.2144，149.1562，108.1380，93.1042，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质2可能为利拉萘酯中的S被O取代和N去甲基，杂质2的结构见图3。
3.2.3 有关物质3 时间为5.642min，一级质谱中主要加合离子为m/z 315.1267，同时还有m/z 337.1955，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2O2S，其二级质谱主要碎片有183.2133， 167.1988， 131.2144， 150.1562，108.1380，93.1042，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质3可能为利拉萘酯中的N去甲基，杂质3的结构见图3。
3.2.4 有关物质4 时间为8.914min，一级质谱中主要加合离子为m/z 313.1474，同时还有m/z 335.1857，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C18H20N2O3，其二级质谱主要碎片181.1988，165.2094，149.1730，108.1380，93.1126，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质4可能为利拉萘酯中的S被O取代，杂质4的结构见图3。
3.2.5 有关物质5 时间为9.348min，一级质谱中主要加合离子为m/z 283.1987，同时还有m/z 305.2213，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2O2，其二级质谱主要碎片151.1998，131.2144，119.2001，79.2214，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质5可能为杂质4去一个甲氧基的产物，杂质5的结构见图3。
3.2.6 有关物质6 时间为10.482min，一级质谱中主要加合离子为m/z 299.1365，同时还有m/z 321.1879，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2OS，其二级质谱主要碎片167.2102， 151.1998，135.1699， 131.2144，79.2214，其二級碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质5可能为利拉萘酯去一个甲氧基的产物，杂质6的结构见图3。
3.3 利拉萘酯杂质来源分析
萘酯原料药中共检测到的6个杂质，根据利拉萘酯合成的相关文献报道，其中杂质2～6均为与主成分结构相似的，为利拉萘酯的去甲基，去甲氧基，硫被氧取代的一系类反应和代谢产物[13-15]，杂质1为合成原料中间体。
4 讨论
文献报道利拉萘酯的含量有关物质检查均采用高效液相色谱法-紫外检测器[16]，在没有对照品的前提下很难对其进行鉴别，本研究参考相关文献建立了UPLC-Q-TOF/MS 分析方法，并对其色谱的梯度条件进行了优化，在该条件下，利拉萘酯及其有关物质都能得到有效分离。研究结果表明，在此色谱条件下，利拉萘酯与其他主要有关物质均能有效分离和鉴定
UPLC-Q-TOF/MS 、超高效液相-四极杆-飞行时间串联质谱技术，该技术既能对化合物进行分离，提供有关物质的二级质谱，又能提供该物质的精确分子量，相比一般质谱技术具有一定优势[17-20]。本研究将UPLC-Q-TOF/MS 技术用于研究利拉萘酯的有关物质分析，并基于此进行了有关物质的结构推断，为利拉萘酯的质量控制和工艺优化提供了参考。
[参考文献]
[1] 钟倩.角鲨烯环氧化酶抑制剂抗真菌药利拉萘酯[J].国外医药（合成药、生化药、制剂分册），2001，22（3）：190. [2] 罗荣.抗真菌药利拉萘酯[J].中国新药杂志，2004，13（12）：1411-1413.
[3] 刘江华，陆宏国，范传文.抗真菌药利拉蔡醋临床研究进展[J].中国现医生，2009，47（32）：25-26.
[4] 刘栋梁，肖涛.有机硫类抗真菌药物的研究进展[J].中国新药杂志，2011，20（20）：137-139.
[5] Momcoucy X，Leymarie F，Delemer B，et al.Risk factors andlongterm course of thyroid dysfunction during antiviral treat-ments in 221 patients with chronic hepatitis C[J].Gastroen-terolClinBiol，2005，29（4）：239-245.
[6] Tiwari RN，Bonde CG.LC–MS/TOF and MSn studies for the identi cation and characterization of degradation products of nel navirmesylate[J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（3）：435-445.
[7] Kaushik D，Bansal G.Characterization of degradation products of idarubicin through LC-UV，MSn and LC–MS-TOF studies[J].J Pharm Biomed Anal，2013，85（0）：123-131.
[8] Shah RP，Sahu A，Singh S.Identi cation and characterization of degradation products of irbesartan using LC-MS/TOF，MSn，on-line H/D exchange and LC-NMR[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51（5）：1037-1046.
[9] Shah RP，Singh S.Identi cation and characterization of a photolytic degradation product of telmisartan using LC–MS/TOF，LC–MSn，LC–NMR and on-line H/D exchange mass studies[J].J Pharm Biomed Anal，2010，53（3）：755-761.
[10] 楊偉峰，许梦佳，石云峰，等.HPLC-Q-TOF-MS分析注射用泮托拉唑钠中降解杂质[J].中国现代应用药学，2016，4（9）：1174-1177.
[11] 黄昕，张超，周翠兰，等.基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技术的盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片杂质的研究[J].中山大学学报（自然科学版），2014，2（4）：101-106.
[12] 陈露，蔡姗英，鲁秋红.LC-Q-TOF/MS方法分析氢溴酸高乌甲素及其注射剂中有关物质[J].药物分析杂志，2013，6（12）：2129-2134.
[13] 陶琼华，王绍杰，刘彬彬.利拉萘酯的合成[J].中国医药工业杂志，2004，35（10）：578-579.
[14] 李伟，常选妞，郝二军，等.利拉萘酯的合成工艺改进[J].中国药物化学杂志，2006，16（2）：106-107.
[15] 邓俊丰，江晓玲，张亚辉，等.利拉萘酯乳膏中杂质的分析、合成和结构鉴定[J].海峡药学，2014，10（26）：63-65.
[16] 龙红萍，徐康平，丁劲松，等.利拉萘酯乳膏含量测定方法学探讨[J].中南药学，2011，9（1）：23-25.
[17] 黄建鹏，贺玖明，朱辉，等.国产高分辨飞行时间质谱仪在药物分子结构鉴定中的应用[J].质谱学报，2016，（5）：431-439.
[18] 潘芳芳.HPLC-QTOF-MS联用技术在药物杂质分析中的运用[D].杭州：浙江工业大学，2013.
[19] 杨丽珍，杨伟峰，石云峰.高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析克拉屈滨注射液中主要杂质及其来源[J].医药导报，2014，3（6）：794-796.
[20] 吴怀秀，王军娟，胡剀，等.RRLC-QTOF鉴定拉科酰胺的未知杂质[J].中国现代应用药学，2014，3（5）：563-566.
（收稿日期：2017-04-05）
[关键词] 利拉萘酯；有关物质；杂质结构鉴定；超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-36-04
Analysis on major impuritiy in liranaftate based on UPLC-Q-TOF-MS/MS
CHEN Danhong1 GU Yong1 CHEN Wenming2 LONG Hongping2
1.The Fifth Hospital of Jiangyin，Jiangyin 214415，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China
[Abstract] Objective To analyze major impuritiy in liranaftate by ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods Chromatographic column was Agilent Extend C18 （2.1×100 mm，1.8μm） and mobile phase was 0.1% formic acid-water（A）-acetonitrile（B） with gradient elution. Volume flow was 0.4m L/min.Ion source was electrospray ionization （ESI） ion source.Scanning mode was positive ion scanning. Results According to secondary mass spectrum of degradation impurity and high resolution data，liranaftate mainly had 6 related substances which are mainly from raw material intermediate and degradation product.Conclusion The established method can effectively separate principal component liranaftate and related substances， which can provide reference for quality control，technology optimization and storage of liranaftate raw medicine.
[Key words] Liranaftate； Related substances；Structure identification of impuritiy；Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry
利拉萘酯（Liranaftate）是是用于皮肤局部感染的新一代抗真菌药，与目前临床上治疗皮肤真菌感染的药物。抗真菌谱广，对包括须发癣菌在内的皮真菌有强大的抗菌活性，对一些致病酵母菌也有很好的活性[1-5]。高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术集液相色谱的高分离能力与质谱的强结构解析能力于一体，已成为药物杂质分析的有力工具[6-12]。由于利拉萘酯的结构不稳定，本文对利拉萘酯原料中的主要杂质进行了研究，以HPLC-MS 技术为分析手段，对其中6个有关物质进行了UPLC-Q-TOF测定，根据其裂解规律推测其可能的结构，为利拉萘酯的质量控制和工艺优化提供了参考。
1 材料
仪器Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）；MassHunter质谱工作站（美国Agilent公司）；BiofugeprimoR台式离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（美国Millipore公司）；x S105 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。
药品与试剂乙腈（质譜纯，德国Omni公司）；实验室自制超纯水；甲酸（质谱纯，美国Sigma公司）；利拉萘酯原料（湖南中医药大学药化研究实验室合成，批号为20161103）。
2 實验方法
2.1 拉萘酯样品溶液的制备
精密称取约20mg利拉萘酯原料，精密加入5.00mL 50%甲醇，超声提取10min，8000rpm离心10min，取上清液，再用甲醇稀释5倍，0.22μm微孔滤膜滤过，即制得利拉萘酯样品溶液。 2.2 色谱条件和质谱条件
色谱条件：色谱柱Agilent Extend C18（2.1×50mm，1.8μm），流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～8 min，15%～25%B；8～12min，25%～35%B，流速：0.4mL/min，进样量：2μL。
质谱检测条件：离子化方式为电喷雾离子化（ESI），准确质量数用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，正离子分析模式，MRE扫描方式。扫描检测，m/z 100～1500，除溶剂气体为氮气，干燥气温度为325℃；干燥气流速：6.8L/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：4.0kV；Fragment电压110V，扫描范围为100 ～ 1000。
3 实验结果
3.1 UPLC-Q-TOF 法分析利拉萘酯原料的主要杂质
采用Q-TOF/MS技术对利拉萘酯中的主要杂质进行分析。在总离子流图中，利拉萘酯原料药中主要检测出6个杂质，结果见图1。根据LC-MS/MS对利拉萘酯进行分析，得到各有关物质的一级、二级质谱信息（表1）数据，对6个杂质的结构进行解析。
3.2 利拉萘酯有关物质的结构鉴定推测
将利拉萘酯各有关物质与利拉萘酯的一级、二级质谱信息进行对比研究，对各有关的物质结构进行解析，推测其可能的化学结构如下：
3.2.1 有关物质1 时间为4.328min，一级质谱中主要加合离子为m/z 199.2133，同時还有m/z 221.1895，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C8H10N2O2S，其二级质谱主要碎片181.1688[M+H-CH3]， 167.1455[M+H-S]， 110.0528[M+H-OHCSNCH3]，推断出杂质1的结构见图3。
3.2.2 有关物质2 时间为5.196min，一级质谱中主要加合离子为m/z 285.1513，同时还有m/z 307.1657，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C16H16N2O3，其二级质谱主要碎片181.2015，131.2144，149.1562，108.1380，93.1042，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质2可能为利拉萘酯中的S被O取代和N去甲基，杂质2的结构见图3。
3.2.3 有关物质3 时间为5.642min，一级质谱中主要加合离子为m/z 315.1267，同时还有m/z 337.1955，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2O2S，其二级质谱主要碎片有183.2133， 167.1988， 131.2144， 150.1562，108.1380，93.1042，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质3可能为利拉萘酯中的N去甲基，杂质3的结构见图3。
3.2.4 有关物质4 时间为8.914min，一级质谱中主要加合离子为m/z 313.1474，同时还有m/z 335.1857，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C18H20N2O3，其二级质谱主要碎片181.1988，165.2094，149.1730，108.1380，93.1126，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质4可能为利拉萘酯中的S被O取代，杂质4的结构见图3。
3.2.5 有关物质5 时间为9.348min，一级质谱中主要加合离子为m/z 283.1987，同时还有m/z 305.2213，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2O2，其二级质谱主要碎片151.1998，131.2144，119.2001，79.2214，其二级碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质5可能为杂质4去一个甲氧基的产物，杂质5的结构见图3。
3.2.6 有关物质6 时间为10.482min，一级质谱中主要加合离子为m/z 299.1365，同时还有m/z 321.1879，推定这两个离子分别为[M+H]+和[M+Na]+，其分子式为C17H18N2OS，其二级质谱主要碎片167.2102， 151.1998，135.1699， 131.2144，79.2214，其二級碎片离子与利拉萘酯的二级碎片离子比较，推断出杂质5可能为利拉萘酯去一个甲氧基的产物，杂质6的结构见图3。
3.3 利拉萘酯杂质来源分析
萘酯原料药中共检测到的6个杂质，根据利拉萘酯合成的相关文献报道，其中杂质2～6均为与主成分结构相似的，为利拉萘酯的去甲基，去甲氧基，硫被氧取代的一系类反应和代谢产物[13-15]，杂质1为合成原料中间体。
4 讨论
文献报道利拉萘酯的含量有关物质检查均采用高效液相色谱法-紫外检测器[16]，在没有对照品的前提下很难对其进行鉴别，本研究参考相关文献建立了UPLC-Q-TOF/MS 分析方法，并对其色谱的梯度条件进行了优化，在该条件下，利拉萘酯及其有关物质都能得到有效分离。研究结果表明，在此色谱条件下，利拉萘酯与其他主要有关物质均能有效分离和鉴定
UPLC-Q-TOF/MS 、超高效液相-四极杆-飞行时间串联质谱技术，该技术既能对化合物进行分离，提供有关物质的二级质谱，又能提供该物质的精确分子量，相比一般质谱技术具有一定优势[17-20]。本研究将UPLC-Q-TOF/MS 技术用于研究利拉萘酯的有关物质分析，并基于此进行了有关物质的结构推断，为利拉萘酯的质量控制和工艺优化提供了参考。
[参考文献]
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[8] Shah RP，Sahu A，Singh S.Identi cation and characterization of degradation products of irbesartan using LC-MS/TOF，MSn，on-line H/D exchange and LC-NMR[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51（5）：1037-1046.
[9] Shah RP，Singh S.Identi cation and characterization of a photolytic degradation product of telmisartan using LC–MS/TOF，LC–MSn，LC–NMR and on-line H/D exchange mass studies[J].J Pharm Biomed Anal，2010，53（3）：755-761.
[10] 楊偉峰，许梦佳，石云峰，等.HPLC-Q-TOF-MS分析注射用泮托拉唑钠中降解杂质[J].中国现代应用药学，2016，4（9）：1174-1177.
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[12] 陈露，蔡姗英，鲁秋红.LC-Q-TOF/MS方法分析氢溴酸高乌甲素及其注射剂中有关物质[J].药物分析杂志，2013，6（12）：2129-2134.
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[14] 李伟，常选妞，郝二军，等.利拉萘酯的合成工艺改进[J].中国药物化学杂志，2006，16（2）：106-107.
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（收稿日期：2017-04-05）