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[摘要]目的：构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP。方法：利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上，通过酶切、序列测定进行鉴定。通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达，并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间。结果：成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白，占菌体总蛋白的15%，主要以包涵体形式表达。结论：成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒，为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制备打下了基础。
[关键词]人硒蛋白 原核表达
中图分类号：R1文献标识码：A 文章编号：1671－7597 (2008) 0310001－01
硒（Selenium）是人体必不可少的微量元素之一，近年来的研究表明硒与心血管疾病、肿瘤等有关[1]，其参与甲状腺激素代谢、抗氧化系统使机体发挥正常免疫功能。硒蛋白（Selenoprotein）是近年来发现的一类通过特殊编码机制编码的蛋白质。硒以硒代半胱氨酸（Sec）的形式，利用三个终止密码子之一的UGA作为三联体密码子，通过一套高度特化的编码和合成机制编码到蛋白质当中，因此Sec被认为是生物体内的第21种氨基酸[2]。
硒蛋白在不同生物中存在差异，目前已知功能的硒蛋白都是重要的酶类。如甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，FDH-H）、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TR）等。在这些硒蛋白酶中，硒元素都位于蛋白酶最重要的活性中心上[3，4，5]。因此，对硒蛋白的研究有助于对硒抗氧化、抗衰老、抗癌、增强免疫力等分子机理的探索。尤其是针对目前未知功能硒蛋白的研究，可望拓宽关于硒的作用机理的研究领域，并提供新的研究动态。
关于真核生物硒蛋白在原核生物中高效表达的研究方面，仅有哺乳动物的硫氧还蛋白还原酶实现了具生物活性的硒蛋白在大肠杆菌中的高效表达[6]。因此人硒蛋白SelK在大肠杆菌中克隆表达可达国际先进水平，它的成功将为以后制备特异抗体，研究其分子功能创造条件。
一、材料与方法
（一）材料
大肠杆菌BL21、DH5α购自北京原平皓公司。原核表达载体pGEX-6P-1购自Pharmacia公司。所用载体pEGFP-C1、pEGFP-N1购自Clonetech公司。IPTG购自上海生工。引物合成由Takara公司完成。其它试剂均为国产分析纯。
（二）方法
1. SelK的cDNA克隆。使用RNAiso Reagent提取人胃上皮癌BGC-823细胞的总RNA，RT-PCR方法扩增获得SelK的cDNA，上游引物序列为：5'-aggagctcaagccaccatgGtttacatctcgaacggaca-3'，下游引物序列为：5'atg
gatccaaccttccacatccaccagccatt-3'。得到去除终止密码子、并将Sec改造成Cys的SelK编码区基因序列。 RT-PCR的参数如下：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，于72℃保温8min。
2. pESelK-GFP的构建。将PCR产物与载体pEGFP-N1分别双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收纯化，连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。提取质粒、酶切鉴定，所获阳性克隆为重组载体pEGFP-SelK。
3. 表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的构建。双酶切pEGFP-SelK获得的SelK-GFP片段为底物作PCR扩增，将PCR回收产物及载体pGEX-6P-1分别用EcoR I与Sal I双酶切、试剂盒回收纯化后，双粘端连接， 转化大肠杆菌感受态细胞BL21。提取质粒、酶切鉴定，所获阳性克隆为表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP。由宝生物公司进行双向测序。
4. 目的蛋白的诱导表达。将含有重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的菌株，接种于LB液体培养基中（含氨苄青霉素10μg/ml），37℃、170 rpm水浴振荡培养过夜。次晨，按1︰20倍扩大培养，于37℃继续振荡培养2hr。至菌液OD=0.6～0.8时，加异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mmol/L，于30℃诱导表达4 hr。离心、收集菌体溶于PBS并超声破碎，取细菌裂解上清及沉淀部分，分别进行SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝染色观察。
二、结果
（一）SelK的cDNA克隆
用于构建重组载体pESelK-GFP的SelK因去除终止密码子TAA及3'-末端基因，其cDNA序列长285bp，加上引物序列共297bp。皮癌BGC-823细胞的总RNA ，经RT-PCR扩增获得SelK的cDNA经琼脂糖电泳，在 DNA 分子质量标样250bp～500bp之间得到单一条带，与预测长度相符（图1）。说明成功获得用于构建重组载体pESelK-GFP的SelK的cDNA。
（二）pESelK-GFP的鉴定
SelK与载体pEGFP-N1经过Sac I和BamH I双酶切和连接酶连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，转化子同样经Sac I和BamH I双酶切鉴定后，产生两条大小分别与目的片段（297bp）和载体骨架片段相符的片段，说明目的片段SelK已插入载体pEGFP-N1中，成功构建获得重组载体pESelK-GFP。（图2）
（三）表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的构建及酶切鉴定
pESelK-GFP与载体pGEX-6P-1经过EcoR I与Sal I双酶切和连接酶连接连接转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，转化子经EcoR I与Sal I双酶切鉴定后，产生两条大小分别与目的片段（bp）和载体骨架片段相符的片段，说明目的片段pESelK-GFP已插入载体pGEX-6P-1中，成功构建重组载体pGEX-6P-1-SelK-GFP。（图3）
（四）目的蛋白的诱导表达
经IPTG诱导表达，对照组pGEX-6P-1经SDS-PAGE可见在26KD处有明显的新生蛋白表达带出现，为标签蛋白GST的表达带；而pGEX-6P-1-SelK-GFP在Mr约为62KD处有明显的新生蛋白表达带出现，为融合蛋白GST-SelK-GFP的表达带，通过凝胶薄层扫描分析，表达产物约占全菌总蛋白量的15%。(图4)
三、讨论
到目前为止，在人类中已经发现了25种硒蛋白[7]。人硒蛋白SelK是人体内尚未阐明其细胞定位、拓扑结构和分子功能的硒蛋白之一，为此本项研究可为以后阐明其细胞定位、拓扑结构，实现其高效表达和获得特异抗体打下基础。
蛋白质的细胞定位和基因的分子功能研究是进行生物体其它研究以及医学治疗和药物合成的重要基础，因此，开展硒蛋白的细胞定位、基因的分子功能和硒蛋白通过在大肠杆菌中高效表达进行制备研究具有重要的意义。绿色荧光蛋白GFP是目前用于目的蛋白示踪和定量的最有用的研究工具，构建人硒蛋白SelK和GFP和标签GST的融合蛋白的表达载体，可以方便于确定硒蛋白SelK在细胞中的位置和在膜上的取向。
用不同浓度的IPTG对表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP转化大肠杆菌BL21进行诱导，发现融合蛋白SelK-GFP在30℃诱导表达4h，IPTG终浓度为0.5mmol/L时表达量最高。SelK的表达成功为以后制备其特异抗体，研究其分子功能奠定了基础。
基金项目：国家自然基金编号（30671176）资助项目。
参考文献：
[1]Burk RF， Selenium，an antioxidant nutrient [J]. Nutr Clin Care， 2002， 5（2）:47-49.
[2]Atkins， J. F.& Gesteland， R. F. The twenty-first amino acid[J]. Nature， 2000， 407 （6803）: 463-465.
[3] Baqui， M.， Botero， D.， Gereben， B.， et al. Human type 3 iodothyronine selenodeiodinase is located in the plasma membrane and undergoes rapid internalization to endosomes[J]. Journal of Biological Chemistry， 2003， 278: 1206-1211.
[4] Bianco， A. C.， Salvatore， D.& Gereben， B. Biochemistry， cellular and molecular biology， and physiological roles of the iodothyronine selenodeiodinases[J]. Endocrine Reviews， 2002， 23: 38-89.
[5]Maiorino， M.， Scapin， M.， Ursini， F.， et al. Distinct promoters determine alternative transcription of gpx-4 into phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase variants [J]. J. Biol. Chem.， 2003， 278: 34286-34290.
[6]Arner E.S.J.， Sarioglu H.， Lottspeich F.， Holmgren A. and A.Bock， （1999） High-level Expression in Escherichia coli of Selenocysteine-containing Rat Thioredoxin Reductase Utilizing Gene Fusions with Engineered Bacterial-type SECIS Elements and Co-expression with selA， selB and selC Genes， J.Mol. Biol. 292，1003-1016.
[7] Kryukov G. V.， Castellano S.， Novoselov S.V.， Lobanov A. V.， Zehtab O.， Guigo R.， Gladyshev V.N.（2003） Characterization of mammalian selenoproteomes， Science， 300， 14391443.
作者简介：
牟藤，男，汉族，预防兽医学硕士，沈阳农业大学；陈长兰，男，汉族，教授，辽宁大学，主要从事分子遗传学专业方向。
[关键词]人硒蛋白 原核表达
中图分类号：R1文献标识码：A 文章编号：1671－7597 (2008) 0310001－01
硒（Selenium）是人体必不可少的微量元素之一，近年来的研究表明硒与心血管疾病、肿瘤等有关[1]，其参与甲状腺激素代谢、抗氧化系统使机体发挥正常免疫功能。硒蛋白（Selenoprotein）是近年来发现的一类通过特殊编码机制编码的蛋白质。硒以硒代半胱氨酸（Sec）的形式，利用三个终止密码子之一的UGA作为三联体密码子，通过一套高度特化的编码和合成机制编码到蛋白质当中，因此Sec被认为是生物体内的第21种氨基酸[2]。
硒蛋白在不同生物中存在差异，目前已知功能的硒蛋白都是重要的酶类。如甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase，FDH-H）、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TR）等。在这些硒蛋白酶中，硒元素都位于蛋白酶最重要的活性中心上[3，4，5]。因此，对硒蛋白的研究有助于对硒抗氧化、抗衰老、抗癌、增强免疫力等分子机理的探索。尤其是针对目前未知功能硒蛋白的研究，可望拓宽关于硒的作用机理的研究领域，并提供新的研究动态。
关于真核生物硒蛋白在原核生物中高效表达的研究方面，仅有哺乳动物的硫氧还蛋白还原酶实现了具生物活性的硒蛋白在大肠杆菌中的高效表达[6]。因此人硒蛋白SelK在大肠杆菌中克隆表达可达国际先进水平，它的成功将为以后制备特异抗体，研究其分子功能创造条件。
一、材料与方法
（一）材料
大肠杆菌BL21、DH5α购自北京原平皓公司。原核表达载体pGEX-6P-1购自Pharmacia公司。所用载体pEGFP-C1、pEGFP-N1购自Clonetech公司。IPTG购自上海生工。引物合成由Takara公司完成。其它试剂均为国产分析纯。
（二）方法
1. SelK的cDNA克隆。使用RNAiso Reagent提取人胃上皮癌BGC-823细胞的总RNA，RT-PCR方法扩增获得SelK的cDNA，上游引物序列为：5'-aggagctcaagccaccatgGtttacatctcgaacggaca-3'，下游引物序列为：5'atg
gatccaaccttccacatccaccagccatt-3'。得到去除终止密码子、并将Sec改造成Cys的SelK编码区基因序列。 RT-PCR的参数如下：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，于72℃保温8min。
2. pESelK-GFP的构建。将PCR产物与载体pEGFP-N1分别双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收纯化，连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。提取质粒、酶切鉴定，所获阳性克隆为重组载体pEGFP-SelK。
3. 表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的构建。双酶切pEGFP-SelK获得的SelK-GFP片段为底物作PCR扩增，将PCR回收产物及载体pGEX-6P-1分别用EcoR I与Sal I双酶切、试剂盒回收纯化后，双粘端连接， 转化大肠杆菌感受态细胞BL21。提取质粒、酶切鉴定，所获阳性克隆为表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP。由宝生物公司进行双向测序。
4. 目的蛋白的诱导表达。将含有重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的菌株，接种于LB液体培养基中（含氨苄青霉素10μg/ml），37℃、170 rpm水浴振荡培养过夜。次晨，按1︰20倍扩大培养，于37℃继续振荡培养2hr。至菌液OD=0.6～0.8时，加异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mmol/L，于30℃诱导表达4 hr。离心、收集菌体溶于PBS并超声破碎，取细菌裂解上清及沉淀部分，分别进行SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝染色观察。
二、结果
（一）SelK的cDNA克隆
用于构建重组载体pESelK-GFP的SelK因去除终止密码子TAA及3'-末端基因，其cDNA序列长285bp，加上引物序列共297bp。皮癌BGC-823细胞的总RNA ，经RT-PCR扩增获得SelK的cDNA经琼脂糖电泳，在 DNA 分子质量标样250bp～500bp之间得到单一条带，与预测长度相符（图1）。说明成功获得用于构建重组载体pESelK-GFP的SelK的cDNA。
（二）pESelK-GFP的鉴定
SelK与载体pEGFP-N1经过Sac I和BamH I双酶切和连接酶连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，转化子同样经Sac I和BamH I双酶切鉴定后，产生两条大小分别与目的片段（297bp）和载体骨架片段相符的片段，说明目的片段SelK已插入载体pEGFP-N1中，成功构建获得重组载体pESelK-GFP。（图2）
（三）表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP的构建及酶切鉴定
pESelK-GFP与载体pGEX-6P-1经过EcoR I与Sal I双酶切和连接酶连接连接转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，转化子经EcoR I与Sal I双酶切鉴定后，产生两条大小分别与目的片段（bp）和载体骨架片段相符的片段，说明目的片段pESelK-GFP已插入载体pGEX-6P-1中，成功构建重组载体pGEX-6P-1-SelK-GFP。（图3）
（四）目的蛋白的诱导表达
经IPTG诱导表达，对照组pGEX-6P-1经SDS-PAGE可见在26KD处有明显的新生蛋白表达带出现，为标签蛋白GST的表达带；而pGEX-6P-1-SelK-GFP在Mr约为62KD处有明显的新生蛋白表达带出现，为融合蛋白GST-SelK-GFP的表达带，通过凝胶薄层扫描分析，表达产物约占全菌总蛋白量的15%。(图4)
三、讨论
到目前为止，在人类中已经发现了25种硒蛋白[7]。人硒蛋白SelK是人体内尚未阐明其细胞定位、拓扑结构和分子功能的硒蛋白之一，为此本项研究可为以后阐明其细胞定位、拓扑结构，实现其高效表达和获得特异抗体打下基础。
蛋白质的细胞定位和基因的分子功能研究是进行生物体其它研究以及医学治疗和药物合成的重要基础，因此，开展硒蛋白的细胞定位、基因的分子功能和硒蛋白通过在大肠杆菌中高效表达进行制备研究具有重要的意义。绿色荧光蛋白GFP是目前用于目的蛋白示踪和定量的最有用的研究工具，构建人硒蛋白SelK和GFP和标签GST的融合蛋白的表达载体，可以方便于确定硒蛋白SelK在细胞中的位置和在膜上的取向。
用不同浓度的IPTG对表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP转化大肠杆菌BL21进行诱导，发现融合蛋白SelK-GFP在30℃诱导表达4h，IPTG终浓度为0.5mmol/L时表达量最高。SelK的表达成功为以后制备其特异抗体，研究其分子功能奠定了基础。
基金项目：国家自然基金编号（30671176）资助项目。
参考文献：
[1]Burk RF， Selenium，an antioxidant nutrient [J]. Nutr Clin Care， 2002， 5（2）:47-49.
[2]Atkins， J. F.& Gesteland， R. F. The twenty-first amino acid[J]. Nature， 2000， 407 （6803）: 463-465.
[3] Baqui， M.， Botero， D.， Gereben， B.， et al. Human type 3 iodothyronine selenodeiodinase is located in the plasma membrane and undergoes rapid internalization to endosomes[J]. Journal of Biological Chemistry， 2003， 278: 1206-1211.
[4] Bianco， A. C.， Salvatore， D.& Gereben， B. Biochemistry， cellular and molecular biology， and physiological roles of the iodothyronine selenodeiodinases[J]. Endocrine Reviews， 2002， 23: 38-89.
[5]Maiorino， M.， Scapin， M.， Ursini， F.， et al. Distinct promoters determine alternative transcription of gpx-4 into phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase variants [J]. J. Biol. Chem.， 2003， 278: 34286-34290.
[6]Arner E.S.J.， Sarioglu H.， Lottspeich F.， Holmgren A. and A.Bock， （1999） High-level Expression in Escherichia coli of Selenocysteine-containing Rat Thioredoxin Reductase Utilizing Gene Fusions with Engineered Bacterial-type SECIS Elements and Co-expression with selA， selB and selC Genes， J.Mol. Biol. 292，1003-1016.
[7] Kryukov G. V.， Castellano S.， Novoselov S.V.， Lobanov A. V.， Zehtab O.， Guigo R.， Gladyshev V.N.（2003） Characterization of mammalian selenoproteomes， Science， 300， 14391443.
作者简介：
牟藤，男，汉族，预防兽医学硕士，沈阳农业大学；陈长兰，男，汉族，教授，辽宁大学，主要从事分子遗传学专业方向。