【摘 要】
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目的 建立一种细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法.方法消化收集处于对数生长期的HepG2.2.15细胞,取1×106个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测.用对数生长期前的细胞培养上清液、4份HBV DNA阳性和2份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光
【机 构】
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200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科,200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科,200003,上海,第二军医大学附属长征医院感染科
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目的 建立一种细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法.方法消化收集处于对数生长期的HepG2.2.15细胞,取1×106个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测.用对数生长期前的细胞培养上清液、4份HBV DNA阳性和2份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光定量PCR法的特异性,并用不同浓度的质粒标准品检测该方法的敏感性.结果证实HepG2.2.15细胞内存在cccDNA,其含量约为每个细胞18拷贝.对数生长期前培养上清液和慢性乙型肝炎(轻度)患者血清均未检测到荧光信号,本实验条件下用该方法可检测低至103拷贝/ml的cccDNA分子.结论该方法操作方便,特异性高,敏感性较好,可用于定量检测细胞内的cccDNA及抗病毒药物的筛选和评价等。
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