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摘要[目的]研究富碳条件下蛋白核小球藻的生长及其对油脂的积累。[方法]通过外加乙酸钠的方法形成小球藻生长的富碳环境，研究小球藻在富碳条件下的生长及其对油脂的积累。[结果]外加一定量的乙酸钠能明显促进蛋白核小球藻的生长（P<0.01），显著提高小球藻中的油脂含量（P<0.01）。[结论]该研究可为小球藻的应用开发及富营养化废水的净化利用提供参考。
关键词蛋白核小球藻；富碳；乙酸钠；生长；油脂积累
中图分类号S181；TS201.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）29-243-02
富营养化养殖废水富含碳、氮、磷等营养元素和有机质，如不经处理直接外排，不仅会导致这些营养元素的流失和浪费，还会造成周边水体的富营养化，引发赤潮等一系列环境污染问题。
小球藻（Chlorella）属绿藻门、绿藻纲、小球藻属。它能够吸收、利用水体中的碳、氮、磷等营养元素和有机质进行生长，具有生存能力强、生态分布广、生长效率高等特点，被认为是生物柴油中最具开发潜力的原料之一。同时，小球藻还富含蛋白质、多糖、维生素及多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等多种活性，在食品添加剂、动物饲料及医药保健等领域有广泛用途。因此，利用富营养化废水培养小球藻，不仅能净化这些废水，而且收获的小球藻还可用于生物柴油、相关食品的开发，这既降低了废水的处理费用，也进一步降低了小球藻的生产开发成本，能起到一举两得的作用。
该研究以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为研究对象，采用外加碳源（乙酸钠）的方法形成小球藻生长的富碳环境，通过研究小球藻在富碳条件下的生长及其油脂含量的变化，以了解小球藻对相关碳源的利用及其对油脂的积累，为小球藻的应用开发及富营养化废水的净化利用提供参考。
1材料与方法
1.1藻种和培养液
试验所用藻种为蛋白核小球藻，为集美大学水产学院环境保护与资源利用实验室培养藻种。所用的培养液为f/2天然海水培养液，其基本组成为NaNO3 74.8 mg/L，NaH2PO4 4.4 mg/L，Na2SiO3 10 mg/L。天然海水取自厦门集美龙舟池养殖场，经漂白粉消毒和硫代硫酸钠调pH至7.0后，可用于上述培养液的配制。
1.2试剂与仪器
漂白粉为市售水产用消毒剂，85%浓H2PO4，98%浓H2SO4，香草醛磷酸溶液浓度为1.978 mg/ml，其余试剂均为分析纯。
UV1100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；OLYMPUSCX37型生物显微镜（上海尚光显微镜有限责任公司）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；H1650台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；YXQLS30SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；PGX280光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）。
1.3试验方法
通过前期研究，该研究选择乙酸钠为外加碳源，并选择1.6 g/L的碳浓度或9.06 g/L的CH3COONa·3H2O为外加碳源的添加浓度。试验分为对照组和富碳组，两组中均接种有相同来源和数量的小球藻。对照组中的培养液为f/2培养液，富碳组的培养液是在f/2培养液中添加外加碳源乙酸钠，并使培养液中的碳浓度达到1.6 g/L（不包括培养液中CO2的碳）。将对照组与富碳组小球藻放置于光照培养箱中培养，光照强度为10 000 lx、温度为25 ℃、光暗比为12 h∶12 h，每天定时取样，分别测定小球藻在680 nm波长下的OD值、细胞数以及培养液中乙酸钠的浓度。观察培养10 d，最后收获小球藻，烘干至恒重后，测定小球藻中的油脂含量。
1.4测定方法
培养液中乙酸钠浓度采用氢氧化钠化学滴定法进行测定，小球藻中脂肪含量采用香草醛比色法 进行测定。
1.5统计分析
试验数据采用excel软件中的t-检验函数进行差异性分析，P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。
2结果与分析
2.1富碳条件下小球藻的生长
分别采用OD法和细胞数法测定了小球藻在富碳条件下（添加乙酸钠）的生长曲线，两种方法都表明小球藻在富碳条件下的生长明显好于对照组（图1），且达到了统计学上的极显著水平（P<0.01）。10 d时间，富碳组小球藻的OD值和细胞数都增长了近4倍，平均每天增长38%或172万cells/ml，而对照组平均每天仅增长7%或32万cells/ml。此外，不论是对照组还是富碳组，两种方法得到的小球藻的生长曲线都极其相似，呈现出较好的一致性。
2.2富碳条件下小球藻对外加碳源的利用
富碳条件下，随着小球藻的OD值从0.2增加到0.9，培养液中的乙酸钠含量也逐步降低，最终降低到初始乙酸钠浓度的47%（图2）。说明培养液中有53%的乙酸钠已被小球藻利用，平均每天利用5.3%或0.085g/L的碳，这也进一步说明蛋白核小球藻能较好地吸收利用乙酸钠进行生长。
通常情况下，小球藻是利用水体中的二氧化碳实现其自养生长。在25 ℃、1个大气压下，水中二氧化碳的溶解度为0.031 3 mol/L。也就是说，在没有外加碳源的条件下，培养液中的碳浓度仅为0.375 6 g/L。而在添加乙酸钠的富碳条件下，培养液中的碳浓度达到1.6 g/L，是小球藻正常自养条件下的4.26倍，这为小球藻的生长提供了充足的碳源。
研究表明，小球藻不仅能利用水体中的二氧化碳进行自养生长，还能利用葡萄糖、乙酸钠等外加碳源，在富碳条件下进行异养和混养生长。但不同外加碳源对小球藻生长的影响不尽相同。葡萄糖能促进小球藻的生长，而乙酸钠对小球藻生长的影响似乎存在一定争议。牛海亚等的研究表明，乙酸钠能促进小球藻的生长；蔡佳佳等发现，在低碳缺硫的培养基中，乙酸钠能明显促进小球藻生长；该研究也表明乙酸钠对蛋白核小球藻的生长是有促进作用的。但刘香华等的研究则发现，在特定培养条件下，乙酸钠并不利于普通小球藻（Chlorella vugaris）的生长。造成这种差异的原因也许可能与小球藻的藻种类型及相关的培养条件有关。 2.3富碳条件下小球藻对油脂的积累
富碳条件下，蛋白核小球藻中的油脂含量比对照组有了明显提高（图3），且达到统计学上的极显著水平（P<0.01），表明外加乙酸钠对蛋白核小球藻的油脂积累有较好的促进作用。
油脂含量是小球藻开发作为生物柴油的一个重要指标。不同藻种、不同培养方式和培养条件对小球藻中的油脂积累都有重要影响。目前发现，原始小球藻（Chlorella protothecoides）、普通小球藻和蛋白核小球藻等多个小球藻藻种都具有较好的油脂积累能力，在某些特定条件下小球藻中的油脂含量最高都可达到干重的50%以上[12-15]。不过，小球藻的油脂含量受培养方式、培养条件等环境因素影响较大。通常在有外加碳源的异养和混养条件下，小球藻的油脂含量要明显高于自养条件下的小球藻。该研究也表明，添加乙酸钠的混养条件下，小球藻的油脂含量比自养条件下有显著的提高。还有研究表明，通过改变培养基配方等方式，小球藻的油脂含量可从10%左右提高到40%以上，能提高3倍以上。因此优化培养基配方、优化培养条件对于提升小球藻的油脂含量具有重要意义。
3结论
外加一定量的乙酸钠能明显促进蛋白核小球藻的生长（P<0.01），明显提高蛋白核小球藻中的油脂含量（P<001），这将进一步提升小球藻在富碳条件下的油脂产量，有助于其生物柴油的开发。小球藻在富碳条件下能较好地利
用乙酸钠，其对乙酸钠的利用率为每天0.085 g/L，而小球藻则以每天172万cells/ml的速度增长。
参考文献
[1] 金城.小球藻生产生物柴油的研究[J].微生物学通报，2010，37（8）：1258.
[2] 孔维宝，李龙囡，张继，等.小球藻的营养保健功能及其在食品工业中的应用[J].食品科学，2010，31（9）：323-328.
[3] 陈明耀.生物饵料培养[M].北京：中国农业出版社，1995.
[4] 顾良忠，张树荣.化学滴定测定醋酸钠含量的新方法[J].广西轻工业，2010（8）：32.
[5] 丛峰，孙雪，徐年军.几种小球藻油脂含量检测方法的比较及优化[J].宁波大学学报（理工版），2012（1）：20-23.
[6] 袁长波，杨家振.278.15至318.15K下二氧化碳在氯化钠葡萄糖水溶液中的溶解度和活度系数[J].高等学校化学学报，1993（1）：80-83.
[7] 牛海亚，马玉龙，石勋祥，等.小球藻适宜碳源及营养方式研究[J].湖北农业科学，2013（24）：6030-6033.
[8] 刘香华，刘雷，曾慧卿.不同碳源及光照对小球藻生长和产油脂的影响[J].安全与环境学报，2012（3）：6-10.
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[10] 杨素玲，孟佑婷，刘桂君，等.小球藻自养、异养和混养特性的研究[J].安徽农业科学，2013（18）：7748-7749.
[11] 蔡佳佳，费小雯，李亚军，等.元素缺乏和外加碳源对小球藻（Chlorella sp KMMCC FC-21）生长和油脂积累的影响[J].热带作物学报，2011（11）：2029-2036.
[12] YAN D，LU Y，CHEN Y F，et al.Waste molasses alone displaces glucose-based medium for microalgal fermentation towards costsaving biodiesel production[J].Bioresour Technol，2011，102（11）：6487-6493.
[13] RISMANIYAZDI H，HAMPEL K H，LANE C D，et al.Highproductivity lipid production using mixed trophic state cultivation of Auxenochlorella（Chlorella）protothecoides[J].Bioprocess Biosyst Eng，2015，38（4）：639-650.
[14] TRAN D T，CHEN C L，CHANG J S.Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oilbearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst[J].Bioresour Technol，2013，135：213-221.
[15] GOUVEIA L，OLIVEIRA A C.Microalgae as a raw material for biofuels production[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36（2）：269-274.
关键词蛋白核小球藻；富碳；乙酸钠；生长；油脂积累
中图分类号S181；TS201.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）29-243-02
富营养化养殖废水富含碳、氮、磷等营养元素和有机质，如不经处理直接外排，不仅会导致这些营养元素的流失和浪费，还会造成周边水体的富营养化，引发赤潮等一系列环境污染问题。
小球藻（Chlorella）属绿藻门、绿藻纲、小球藻属。它能够吸收、利用水体中的碳、氮、磷等营养元素和有机质进行生长，具有生存能力强、生态分布广、生长效率高等特点，被认为是生物柴油中最具开发潜力的原料之一。同时，小球藻还富含蛋白质、多糖、维生素及多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力等多种活性，在食品添加剂、动物饲料及医药保健等领域有广泛用途。因此，利用富营养化废水培养小球藻，不仅能净化这些废水，而且收获的小球藻还可用于生物柴油、相关食品的开发，这既降低了废水的处理费用，也进一步降低了小球藻的生产开发成本，能起到一举两得的作用。
该研究以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）为研究对象，采用外加碳源（乙酸钠）的方法形成小球藻生长的富碳环境，通过研究小球藻在富碳条件下的生长及其油脂含量的变化，以了解小球藻对相关碳源的利用及其对油脂的积累，为小球藻的应用开发及富营养化废水的净化利用提供参考。
1材料与方法
1.1藻种和培养液
试验所用藻种为蛋白核小球藻，为集美大学水产学院环境保护与资源利用实验室培养藻种。所用的培养液为f/2天然海水培养液，其基本组成为NaNO3 74.8 mg/L，NaH2PO4 4.4 mg/L，Na2SiO3 10 mg/L。天然海水取自厦门集美龙舟池养殖场，经漂白粉消毒和硫代硫酸钠调pH至7.0后，可用于上述培养液的配制。
1.2试剂与仪器
漂白粉为市售水产用消毒剂，85%浓H2PO4，98%浓H2SO4，香草醛磷酸溶液浓度为1.978 mg/ml，其余试剂均为分析纯。
UV1100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；OLYMPUSCX37型生物显微镜（上海尚光显微镜有限责任公司）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；H1650台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；YXQLS30SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）；PGX280光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）。
1.3试验方法
通过前期研究，该研究选择乙酸钠为外加碳源，并选择1.6 g/L的碳浓度或9.06 g/L的CH3COONa·3H2O为外加碳源的添加浓度。试验分为对照组和富碳组，两组中均接种有相同来源和数量的小球藻。对照组中的培养液为f/2培养液，富碳组的培养液是在f/2培养液中添加外加碳源乙酸钠，并使培养液中的碳浓度达到1.6 g/L（不包括培养液中CO2的碳）。将对照组与富碳组小球藻放置于光照培养箱中培养，光照强度为10 000 lx、温度为25 ℃、光暗比为12 h∶12 h，每天定时取样，分别测定小球藻在680 nm波长下的OD值、细胞数以及培养液中乙酸钠的浓度。观察培养10 d，最后收获小球藻，烘干至恒重后，测定小球藻中的油脂含量。
1.4测定方法
培养液中乙酸钠浓度采用氢氧化钠化学滴定法进行测定，小球藻中脂肪含量采用香草醛比色法 进行测定。
1.5统计分析
试验数据采用excel软件中的t-检验函数进行差异性分析，P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。
2结果与分析
2.1富碳条件下小球藻的生长
分别采用OD法和细胞数法测定了小球藻在富碳条件下（添加乙酸钠）的生长曲线，两种方法都表明小球藻在富碳条件下的生长明显好于对照组（图1），且达到了统计学上的极显著水平（P<0.01）。10 d时间，富碳组小球藻的OD值和细胞数都增长了近4倍，平均每天增长38%或172万cells/ml，而对照组平均每天仅增长7%或32万cells/ml。此外，不论是对照组还是富碳组，两种方法得到的小球藻的生长曲线都极其相似，呈现出较好的一致性。
2.2富碳条件下小球藻对外加碳源的利用
富碳条件下，随着小球藻的OD值从0.2增加到0.9，培养液中的乙酸钠含量也逐步降低，最终降低到初始乙酸钠浓度的47%（图2）。说明培养液中有53%的乙酸钠已被小球藻利用，平均每天利用5.3%或0.085g/L的碳，这也进一步说明蛋白核小球藻能较好地吸收利用乙酸钠进行生长。
通常情况下，小球藻是利用水体中的二氧化碳实现其自养生长。在25 ℃、1个大气压下，水中二氧化碳的溶解度为0.031 3 mol/L。也就是说，在没有外加碳源的条件下，培养液中的碳浓度仅为0.375 6 g/L。而在添加乙酸钠的富碳条件下，培养液中的碳浓度达到1.6 g/L，是小球藻正常自养条件下的4.26倍，这为小球藻的生长提供了充足的碳源。
研究表明，小球藻不仅能利用水体中的二氧化碳进行自养生长，还能利用葡萄糖、乙酸钠等外加碳源，在富碳条件下进行异养和混养生长。但不同外加碳源对小球藻生长的影响不尽相同。葡萄糖能促进小球藻的生长，而乙酸钠对小球藻生长的影响似乎存在一定争议。牛海亚等的研究表明，乙酸钠能促进小球藻的生长；蔡佳佳等发现，在低碳缺硫的培养基中，乙酸钠能明显促进小球藻生长；该研究也表明乙酸钠对蛋白核小球藻的生长是有促进作用的。但刘香华等的研究则发现，在特定培养条件下，乙酸钠并不利于普通小球藻（Chlorella vugaris）的生长。造成这种差异的原因也许可能与小球藻的藻种类型及相关的培养条件有关。 2.3富碳条件下小球藻对油脂的积累
富碳条件下，蛋白核小球藻中的油脂含量比对照组有了明显提高（图3），且达到统计学上的极显著水平（P<0.01），表明外加乙酸钠对蛋白核小球藻的油脂积累有较好的促进作用。
油脂含量是小球藻开发作为生物柴油的一个重要指标。不同藻种、不同培养方式和培养条件对小球藻中的油脂积累都有重要影响。目前发现，原始小球藻（Chlorella protothecoides）、普通小球藻和蛋白核小球藻等多个小球藻藻种都具有较好的油脂积累能力，在某些特定条件下小球藻中的油脂含量最高都可达到干重的50%以上[12-15]。不过，小球藻的油脂含量受培养方式、培养条件等环境因素影响较大。通常在有外加碳源的异养和混养条件下，小球藻的油脂含量要明显高于自养条件下的小球藻。该研究也表明，添加乙酸钠的混养条件下，小球藻的油脂含量比自养条件下有显著的提高。还有研究表明，通过改变培养基配方等方式，小球藻的油脂含量可从10%左右提高到40%以上，能提高3倍以上。因此优化培养基配方、优化培养条件对于提升小球藻的油脂含量具有重要意义。
3结论
外加一定量的乙酸钠能明显促进蛋白核小球藻的生长（P<0.01），明显提高蛋白核小球藻中的油脂含量（P<001），这将进一步提升小球藻在富碳条件下的油脂产量，有助于其生物柴油的开发。小球藻在富碳条件下能较好地利
用乙酸钠，其对乙酸钠的利用率为每天0.085 g/L，而小球藻则以每天172万cells/ml的速度增长。
参考文献
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[11] 蔡佳佳，费小雯，李亚军，等.元素缺乏和外加碳源对小球藻（Chlorella sp KMMCC FC-21）生长和油脂积累的影响[J].热带作物学报，2011（11）：2029-2036.
[12] YAN D，LU Y，CHEN Y F，et al.Waste molasses alone displaces glucose-based medium for microalgal fermentation towards costsaving biodiesel production[J].Bioresour Technol，2011，102（11）：6487-6493.
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[14] TRAN D T，CHEN C L，CHANG J S.Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oilbearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst[J].Bioresour Technol，2013，135：213-221.
[15] GOUVEIA L，OLIVEIRA A C.Microalgae as a raw material for biofuels production[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36（2）：269-274.