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论文摘要： 目的 优选丹参脂溶性及水溶性成分的集成提取工艺条件。方法 采用正交设计法，以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为测定指标，采用高效液相色谱法测定其含量，并以此为指标优选集成提取工艺条件。
主题词：丹参 成份 测定
中图分类号：O723+.6
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，主要含有二萜醌类脂溶性及酚酸类水溶性成分。2005年版《中华人民共和国药典》（一部）以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为指标，对丹参药材进行质量控制。为了能同时兼顾丹参脂溶性及水溶性两类有效成分，我们采用正交试验法，以丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量为考察指标，对丹参的提取工艺进行全面优选，以使丹参的提取工艺更科学、合理。
一、仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪。丹参酮ⅡA（批号110766- 200518）、丹酚酸B（批号111562-200605）标准品购自中国药品生物制品检定所；丹参药材购自安国药材市场（经河北省药品检验所中药室孙宝惠主任药师鉴定为正品）。甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
二、方法与结果
1 、丹参提取液中丹参酮ⅡA的含量测定方法
采用Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，广州菲罗门科学仪器有限公司），流动相：甲醇-水（75∶25），流速：1.0 mL/min，检测波长：270 nm。精密称取丹参酮ⅡA对照品10.21 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每1 mL中含丹参酮ⅡA 16.32 μg）。分别取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定回流液中丹参酮ⅡA的含量。
2、丹参提取液中丹酚酸B的含量测定方法
采用Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；流速：1.0 mL/min；检测波长：286 nm。精密称取丹酚酸B 8.20 mg至10 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中，以75%甲醇定容至刻度，摇匀，得164.0 μg/mL的丹酚酸B标准品溶液。分别吸取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液10 mL至25 mL的棕色容量瓶中，以相应溶剂稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定回流液中丹酚酸B的含量。
3 、 提取溶剂的选择
丹参脂溶性成分易溶于高浓度乙醇，但在预试验中，丹酚酸B在醇提时亦有相当部分被提取出来，所以考虑采用脂溶性部位与水溶性部位进行集成提取，以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为含量测定指标，考察乙醇浓度对丹参脂溶性成分及水溶性成分提取率的影响。
称取丹参药材8份，每份30.0 g，平行2组，分别以8倍量水及10%、30%、50%、60%、70%、90%及95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL。将以上药液取适量，按照上述含量测定方法测定丹参药材及各提取方法样品中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量，并计算提取率。
90%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率最高，为81.6%，但丹酚酸B提取率仅为48.3%；50%乙醇提取时，丹酚酸B提取率最高为75.1%，但丹参酮ⅡA的提取率仅为40.1%；70%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率为80.7%，丹酚酸B提取率为73.2%。为兼顾二者，我们初步选择70%乙醇进行提取。
为验证高浓度乙醇提取后药渣中丹酚酸B的含量，取70%、90%、95%乙醇提取后的药渣再加8倍量的水回流提取2次，每次1 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL。样品液处理后以HPLC法进行测定。结果表明：70%、90%及95%乙醇提取再水提的丹酚酸B的提取率分别为2.7%、18.4%及36.4%，均较低。由此可看出，醇提后再水提的工艺条件不合理，其原因可能是丹酚酸B长时间受热，导致分解，使提取率降低，因此，确定采用70%乙醇进行集成提取的工艺条件可行。
4 、 药材粉碎粒度的考察
称取丹参药材饮片、最粗粉及粗粉各30.0 g，平行2组，分别以8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL，摇匀，取适量以0.45 μm微孔滤膜过滤，以HPLC法测定丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率。
饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率均较最粗粉高，但饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率在同一水平；饮片、最粗粉及粗粉提取时丹酚酸B提取率分别为77.2%、80.5%、78.3%，三者在同一水平。从工业生产成本角度考虑，选择饮片直接提取即可。
5 、 正交试验
1）正交试验设计
选择乙醇用量、提取时间和提取次数3个因素，进行L9（34）正交设计；并以丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率为指标，优选丹参合提工艺条件。因素水平见表3。
2） 正交试验与结果分析
平行称取丹参药材9份，每份30 g，按L9（34）正交表试验条件，用70%乙醇进行加热回流提取、滤过，滤液合并至1 000 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，测定。
方差和直观分析结果表明：因素C对丹参酮ⅡA及丹酚酸B的提取有显著影响，取3水平；其次为A因素，取3水平；B因素影响最小，可取1水平；最佳提取条件应为A3B1C3，但A和C因素的2水平与3水平相差不大，结合生产，拟取2水平，故拟确定提取条件为A2B1C2，即加8倍量70%乙醇，提取2次，每次1 h。
6 、验证试验
按照正交试验优选醇提工艺条件进行验证试验，结果见表7；结合工业生产，选择优选工艺为丹参提取工艺，与正交试验各工艺结果比较含量较高，表明丹参脂溶性成分及水溶性成分基本提取完全，该醇提工艺条件可行。表7 丹参醇提工艺验证结果（略）
三、讨论
以醇提法从丹参中提取的水溶性成分主要是丹酚酸B，以水提法则包含丹酚酸B、丹参素及原儿茶醛等水溶性成分。药理研究表明，两种提取方法所得部位的药理作用差异无统计学意义，且以醇提法所得的结果较好，并且随丹酚酸B含量提高而活性提高。鉴于此，我们选择丹酚酸B为水溶性成分的考察指标。
丹参水溶性成分中，主成分丹酚酸B对热不稳定，这在提取溶剂的选择中可看出。因此，我们先采用高浓度醇提再用水提，丹酚酸B提取率较低，可能为丹酚酸B长时间受热分解所致。为全面反映丹参有效成分，我们采用先醇提再水提的传统工艺与集成提取工艺相比较，得出集成提取的优选工艺。
研究表明，集成提取能同时兼顾丹参脂溶性和水溶性成分，使丹参的提取工艺更为合理。
参考文献：
[1] 任志会，苏会霞，柏艳柳，丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究，论文网，2011，06
主题词：丹参 成份 测定
中图分类号：O723+.6
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，主要含有二萜醌类脂溶性及酚酸类水溶性成分。2005年版《中华人民共和国药典》（一部）以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为指标，对丹参药材进行质量控制。为了能同时兼顾丹参脂溶性及水溶性两类有效成分，我们采用正交试验法，以丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量为考察指标，对丹参的提取工艺进行全面优选，以使丹参的提取工艺更科学、合理。
一、仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪。丹参酮ⅡA（批号110766- 200518）、丹酚酸B（批号111562-200605）标准品购自中国药品生物制品检定所；丹参药材购自安国药材市场（经河北省药品检验所中药室孙宝惠主任药师鉴定为正品）。甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
二、方法与结果
1 、丹参提取液中丹参酮ⅡA的含量测定方法
采用Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，广州菲罗门科学仪器有限公司），流动相：甲醇-水（75∶25），流速：1.0 mL/min，检测波长：270 nm。精密称取丹参酮ⅡA对照品10.21 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每1 mL中含丹参酮ⅡA 16.32 μg）。分别取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定回流液中丹参酮ⅡA的含量。
2、丹参提取液中丹酚酸B的含量测定方法
采用Phenomenex Luna C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；流速：1.0 mL/min；检测波长：286 nm。精密称取丹酚酸B 8.20 mg至10 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中，以75%甲醇定容至刻度，摇匀，得164.0 μg/mL的丹酚酸B标准品溶液。分别吸取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液10 mL至25 mL的棕色容量瓶中，以相应溶剂稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定回流液中丹酚酸B的含量。
3 、 提取溶剂的选择
丹参脂溶性成分易溶于高浓度乙醇，但在预试验中，丹酚酸B在醇提时亦有相当部分被提取出来，所以考虑采用脂溶性部位与水溶性部位进行集成提取，以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为含量测定指标，考察乙醇浓度对丹参脂溶性成分及水溶性成分提取率的影响。
称取丹参药材8份，每份30.0 g，平行2组，分别以8倍量水及10%、30%、50%、60%、70%、90%及95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL。将以上药液取适量，按照上述含量测定方法测定丹参药材及各提取方法样品中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量，并计算提取率。
90%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率最高，为81.6%，但丹酚酸B提取率仅为48.3%；50%乙醇提取时，丹酚酸B提取率最高为75.1%，但丹参酮ⅡA的提取率仅为40.1%；70%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率为80.7%，丹酚酸B提取率为73.2%。为兼顾二者，我们初步选择70%乙醇进行提取。
为验证高浓度乙醇提取后药渣中丹酚酸B的含量，取70%、90%、95%乙醇提取后的药渣再加8倍量的水回流提取2次，每次1 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL。样品液处理后以HPLC法进行测定。结果表明：70%、90%及95%乙醇提取再水提的丹酚酸B的提取率分别为2.7%、18.4%及36.4%，均较低。由此可看出，醇提后再水提的工艺条件不合理，其原因可能是丹酚酸B长时间受热，导致分解，使提取率降低，因此，确定采用70%乙醇进行集成提取的工艺条件可行。
4 、 药材粉碎粒度的考察
称取丹参药材饮片、最粗粉及粗粉各30.0 g，平行2组，分别以8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，药液过滤，合并，放置室温，定容至1 000 mL，摇匀，取适量以0.45 μm微孔滤膜过滤，以HPLC法测定丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率。
饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率均较最粗粉高，但饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率在同一水平；饮片、最粗粉及粗粉提取时丹酚酸B提取率分别为77.2%、80.5%、78.3%，三者在同一水平。从工业生产成本角度考虑，选择饮片直接提取即可。
5 、 正交试验
1）正交试验设计
选择乙醇用量、提取时间和提取次数3个因素，进行L9（34）正交设计；并以丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率为指标，优选丹参合提工艺条件。因素水平见表3。
2） 正交试验与结果分析
平行称取丹参药材9份，每份30 g，按L9（34）正交表试验条件，用70%乙醇进行加热回流提取、滤过，滤液合并至1 000 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，测定。
方差和直观分析结果表明：因素C对丹参酮ⅡA及丹酚酸B的提取有显著影响，取3水平；其次为A因素，取3水平；B因素影响最小，可取1水平；最佳提取条件应为A3B1C3，但A和C因素的2水平与3水平相差不大，结合生产，拟取2水平，故拟确定提取条件为A2B1C2，即加8倍量70%乙醇，提取2次，每次1 h。
6 、验证试验
按照正交试验优选醇提工艺条件进行验证试验，结果见表7；结合工业生产，选择优选工艺为丹参提取工艺，与正交试验各工艺结果比较含量较高，表明丹参脂溶性成分及水溶性成分基本提取完全，该醇提工艺条件可行。表7 丹参醇提工艺验证结果（略）
三、讨论
以醇提法从丹参中提取的水溶性成分主要是丹酚酸B，以水提法则包含丹酚酸B、丹参素及原儿茶醛等水溶性成分。药理研究表明，两种提取方法所得部位的药理作用差异无统计学意义，且以醇提法所得的结果较好，并且随丹酚酸B含量提高而活性提高。鉴于此，我们选择丹酚酸B为水溶性成分的考察指标。
丹参水溶性成分中，主成分丹酚酸B对热不稳定，这在提取溶剂的选择中可看出。因此，我们先采用高浓度醇提再用水提，丹酚酸B提取率较低，可能为丹酚酸B长时间受热分解所致。为全面反映丹参有效成分，我们采用先醇提再水提的传统工艺与集成提取工艺相比较，得出集成提取的优选工艺。
研究表明，集成提取能同时兼顾丹参脂溶性和水溶性成分，使丹参的提取工艺更为合理。
参考文献：
[1] 任志会，苏会霞，柏艳柳，丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究，论文网，2011，06