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摘要：【目的】明確广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响，为H9亚型禽流感（AI）的防控提供参考依据。【方法】从广西某肉鸡养殖场采集病料，经SPF鸡胚接种进行病毒分离，对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析，同时对分离毒株的生物学特性进行测定。【结果】从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV，命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF，具有典型的低致病性AIV（LPAIV）分子特征，在遗传进化关系上属于4.2.5分支，与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异；其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）同时具备与α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受体结合的特性，且具有感染人类的潜在风险；其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏，可通过呼吸道和消化道同时排毒，且在攻毒后第1 d即开始排毒，第5 d为排毒高峰。【结论】从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV，是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株，可导致鸡群疫苗免疫失败，且具有感染人类的潜在风险。
关键词： 禽流感病毒（AIV）；H9N2亚型；分离鉴定；遗传进化；裂解位点；受体结合特性；广西
中图分类号： S858.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0780-07
Isolation and identification of H9N2 subtype avian influenza virus from chicken in Guangxi and its genetic evolution
ZHANG Yan-wen1，2， HE Yong-quan3， WU Yun-yue1， YU Dong-ling1，
ZENG Wen-bang1， NING Zhi-peng1
（1Nanning University， Nanning 530200， China； 2The State Key Laboratory of Virology， Wuhan 430072， China；
3 Nanning Shanfeng Agriculture and Livestock Husbandry Investment Co.， Ltd.， Nanning 530000， China）
Abstract：【Objective】This study determined molecular genetic variation regularity of H9N2 subtype avian influenza virus（AIV） and its effects on public health safety of human so as to provide reference for the prevention and control of H9 subtype avian influenza（AI）. 【Method】Suspected tissue samples were collected from one chicken farm in Guangxi， viral isolation was performed by inoculating SPF chicken embryo. The virus was preliminarily identified as H9 subtype AIV isolated strain. Then eight gene fragments isolated from H9 subtype AIV including HA，NA，PB2，PB，PA，NP，M and NS were sequenced， and their genetic evolution was analyzed. The biological characteristics of the isolated strain were also determined at the same time. 【Result】A H9N2 subtype AIV strain， named A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），was successfully separated from the sick chicken population in Guangxi. The cleavage site of HA gene in A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） was PSRSSR↓GLF， which had typical features of low pathogenic AIV（LPAIV） molecule. In genetic evolution relation，it belonged to 4.2.5 branch， and had some differences with the domestic H9N2 subtype AIV vaccine strains which belonged to 4.2.3 branch. The other seven genes were also derived from different AIV subtypes. The isolated virus strain A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） could bind to α-2，3 sialic acid and α-2，6 sialic acid receptors， with the potential risk to infect human. Virus distribution was mainly concentrated in trachea， lung and spleen after it infected chicken， and the virus also could be released through the respiratory tract and digestive tract at same time. The virus was released from day 1 and peaked on the day 5 after the chicken was infected. 【Conclusion】A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），isolated from Guangxi sick chicken population， belonged to LPAIV. It is a H9N2 subtype new virus created by different subtypes AIV. It can lead to the failure of chicken vaccine immunization and has the potential risk of infecting human beings. Key words：avian influenza virus（AIV）；H9N2 subtype； isolation and identification； genetic evolution； cleavage site； receptor-binding specificity； Guangxi
0 引言
【研究意义】禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类呼吸道传染病。AIV基因组由8个大小不同的基因片段组成，分别为HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS（韦平和秦爱建，2008），因其开放阅读框（ORF）的不同可编码至少12种蛋白（谭伟和谢芝勋，2014）。根据病毒表面糖蛋白（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，AIV可划分为18个HA亚型和11个NA亚型（Tong et al.，2013；Zhu et al.，2013；吴青等，2017）；而依据AIV对SPF鸡致病性的强弱，又将其分为高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）两种类型（王秀荣和陈化兰，2015）。H9N2亚型AIV属于LPAIV，但其感染鸡群后会引起免疫抑制，进而导致其他病原体感染率上升，增加发病鸡群因继发或混合感染引起的死亡率。同时，H9N2亚型AIV可直接感染人类或为其他流感病毒感染人类提供内部基因，严重威胁公共卫生安全（魏宝之，2013）。因此，加强H9N2亚型AIV遗传变异规律研究对有效防控AI具有重要意义。【前人研究进展】1994年，陈伯伦等从我国广东的发病鸡群中首次分离获得H9N2亚型AIV，随后H9N2亚型AIV在我国多个省（区）暴发和流行，给家禽养殖业带来巨大经济损失（顾敏等，2015）。H9N2亚型AIV某些特异性受体结合位点的突变可致使其跨越种属屏障而感染哺乳动物及人类（王爱荣，2015），1997年在广东和香港相继出现H9N2亚型AIV直接感染人类并表现出严重临床症状的病例（郭元吉等，1999；Peiris et al.，1999），随后大量研究证实，H9N2亚型AIV可为H10N8、H6N1、H7N9和H5N6亚型AIV感染人类时提供内部基因（Liu et al.，2013，2014；Chen et al.，2014；Xu et al.，2016）。近年来，国内外学者对H9N2亚型AIV流行病学及其遗传变异情况进行深入研究分析，发现该亚型病毒的HA基因变异速率在不断加快，且其内部基因的构成及来源也越来越复杂，导致疫苗免疫失败及人类感染事件时有发生（孟芳等，2016；杨均等，2016；张静等，2016；Wei et al.，2016；Pan et al.，2017）。【本研究切入点】目前，关于广西H9N2亚型AIV流行病学及其基因组测序的研究已有报道（谢芝勋等，2007；屈素洁等，2016），但针对该亚型病毒尤其是鸡源H9N2亚型AIV在广西地区遗传变异的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从呈现呼吸道症状的肉鸡群中采集病料，经SPF鸡胚接种进行病毒分离，对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆，并通过测序分析和构建遗传进化树，明确广西鸡源H9N2亚型AIV的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响，进而为H9亚型AI的防控提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2016年广西某肉鸡养殖场35日龄的三黄鸡群疑似感染AIV，患病肉鸡主要表现为呼吸道症状，剖检发现其腺胃乳头凹凸不平，个别乳头有出血点，支气管有干酪样栓塞。该鸡群在12日龄时进行过H9亚型AIV灭活苗免疫。病毒分离材料为发病鸡的肺脏和支气管；SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物有限公司提供种蛋，自行孵化；H9亚型AI HA抗原和HI特异性抗体购自哈尔滨维科生物技术开发公司；One Step RT-PCR Kit、pMD18-T载体、α-2，3唾液酸酶和DNA Marker购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒、DNA纯化/回收试剂盒购和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；1%绵羊红细胞和1%鸡红细胞由病毒学国家重点实验室自行制备，其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 病毒分离纯化及鉴定
将具有明显病变的肺脏和支气管病料样品按比例加入生理盐水进行研磨，反复冻融3次后8000 r/min离心5 min，取其上清液用0.22 μm一次性滤器进行过滤。采用尿囊腔接种方式将上清液接种至9日龄SPF鸡胚中，37 ℃孵育观察96 h，收集死亡和未死亡鸡胚的尿囊液，分别以血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）鉴定病毒增殖效果。其中，HI试验结果呈阳性的样品参照仇保丰等（2010）的方法，通过有限稀释法进行连续3轮的克隆纯化，纯化后的样品增殖培养并超速离心后，-80 ℃保存备用。
1. 3 基因组RT-PCR扩增及测序
使用RNA提取试剂盒提取鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA，同时参照Hoffmann等（2001）的方法合成扩增引物，并按照One Step RT-PCR Kit試剂盒说明采用一步法扩增病毒基因组的8个基因片段；所得PCR产物经切胶纯化，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，经扩大培养后挑取单个菌落进行PCR鉴定，鉴定结果呈阳性的菌液送至深圳华大基因公司进行测序。
1. 4 基因组遗传进化分析
应用DNASTAR对各基因片段的测序结果进行比对分析，将整理后正确的核苷酸序列以MEGA 7.0中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree绘制遗传进化树，分析其遗传进化关系。
1. 5 AIV受体结合特性测定 采用红细胞法测定AIV受体结合特性（屈亚锦等，2013），即采用经α-2，3唾液酸酶处理的1%鸡红细胞、1%绵羊红细胞及1%鸡红细胞分别对待测病毒进行HA试验，然后根据待测病毒与上述不同红细胞结合特性的差异判定其受体亲和性及是否存在感染人类的潜在可能性。
1. 6 病毒感染性试验
将30羽4周龄的健康非免疫鸡随机平均分成两组，其中一组作为空白对照组，另一组为感染组，即将AIV分离株鸡胚尿囊液稀释至106 EID50/100 μL，经静脉注射感染试验鸡（100 μL/羽）。病毒感染后连续观察记录试验鸡的临床症状，并分别于攻毒后第1、3、5、7、9、11和14 d采集对照组和感染组试验鸡的咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离，检测病毒感染试验鸡后的排毒情况；同时在攻毒后第3 d每组随机剖检3羽试验鸡，采集其气管、肺脏、心脏、脾脏、盲肠扁桃体、肾脏和肝脏等器官组织进行病毒滴定试验。攻毒后第14 d剖杀所有存活试验鸡并剖检观察其病变，然后综合上述试验结果评价该病毒分离株对鸡的致病性及病毒的复制和排毒情况。
2 结果与分析
2. 1 病毒分离及HA亚型血清学鉴定结果
利用SPF鸡胚进行病毒分离，并对HA效价≥5log2的鸡胚尿囊液进行HI试验，其血清学鉴定结果表明分离获得一株抗H9阳性血清且HI效价为6log2的AIV。
2. 2 病毒纯化结果
采用有限稀释法对AIV分离株进行克隆纯化，通过连续3代的纯化得到抗H9阳性血清且HI效价为9log2的毒株。将第4代鸡胚尿囊液以低速离心机离心后取上清液再进行超速离心（40000 r/min离心4 h），弃上清液，其沉淀用1 mL灭菌生理盐水悬浮后保存备用。
2. 3 病毒全基因RT-PCR扩增及测序结果
分离毒株经RT-PCR扩增均可获得与预期结果相符的8个目的基因条带（图1）。试剂盒回收各基因扩增目的片段，连接至pMD18-T载体后转化DH5α感受态细胞，进行扩大培养，将PCR鉴定呈阳性的菌液送至深圳华大基因公司进行测序，根据DNASTAR测序结果进行比对拼接，并登陆NCBI进行基因同源性BLAST比对分析，结果发现HA和NA基因测序结果与H9N2亚型AIV的核苷酸同源性最高，分别为99%和98%；其余6个内部基因则与GenBank中其他AIV相应基因核苷酸序列高度同源（表1）。综合其血清学鉴定结果，将该分离毒株命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）。
2. 4 基因组遗传进化分析结果
分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）HA基因ORF为1683 bp，编码560个氨基酸，与参考毒株（常见进化分支的代表性毒株）进行比对分析未发现有碱基插入或缺失。HA基因可被蛋白酶裂解成HA1和HA2两个编码区，分别编码321和221个氨基酸，HA裂解位点为PSRSSR↓GLF，该特征为典型的LPAIV分子特征。HA受体结合位点的第226位（参照H3亚型编号）氨基酸如发生突变（Q→L），则表明该病毒对人流感病毒受体SAα-2，6的识别能力提高。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与越南分离毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，与目前国内常用H9N2亚型AIV疫苗株的同源性却在95%以下。基于HA基因核苷酸序列的遗传进化分析结果也表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于4.2.5分支，与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所处的4.2.3分支属于不同小分支，存在一定差异（图2）。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）NA基因ORF为1401 bp，编码466个氨基酸，与广西分离毒株A/turtledove/Guangxi/49B6/2013（H9N2）的NA基因核苷酸同源性在98%以上，处在同一分支上（图3）。其他6个内部基因（PB1、PB2、PA、NP、M和NS）的编码区长度分别为2274、2280、2151、1497、982和828 bp，依据其对应的核苷酸序列分别构建遗传进化树，结果显示分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与广西周边地区和国家的分离毒株亲缘关系密切，處于欧亚分支上，与北美分离毒株的亲缘关系较远且处在不同分支上。进一步的序列比对分析结果表明，这些内部基因分别与H9N2、H7N9、H6N2和H10N8等亚型AIV相应基因核苷酸序列存在较高的同源性，说明其内部基因可能来源于上述参考毒株，也提示分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）的内部基因来源关系较复杂。
2. 5 AIV受体结合特性分析结果
因含不同受体的AIV与不同动物红细胞的结合能力也不同，故采用常规HA试验测定其受体结合特性。以只含α-2，6唾液酸受体的绵羊红细胞和经α-2，3唾液酸处理的鸡红细胞分别与待测分离毒株进行HA试验，结果表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与含有α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受体的红细胞均能结合，但与含α-2，6唾液酸受体红细胞的结合能力更强，说明该分离毒株同时具备与α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受体结合的特性，且具有感染人类的潜在风险。
2. 6 病毒感染性试验结果
感染组的15羽健康非免疫鸡在攻毒后均未表现出明显的临床症状和死亡情况，说明分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV。攻毒后第3 d剖检，仅发现气管充血并有少量黏液，腺胃内黏液增多，其他脏器均未见明显病变。各脏器病毒滴定结果表明，病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏（表2）。咽喉和泄殖腔棉拭子病毒检测结果显示，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）可通过呼吸道和消化道同时排毒，且在攻毒后第1 d即开始排毒，第5 d为排毒高峰。 3 讨论
本研究从广西发病鸡群中分离获得一株H9亚型AIV[A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）]，其HA试验结果显示该分离毒株具有直接凝集鸡红细胞的特性，而HI试验结果显示该分离毒株只能被H9亚型AIV标准阳性血清所抑制，即血清学鉴定结果初步证实该分离毒株为H9亚型AIV。同时对分离毒株的8个基因进行克隆及测序分析，其中，HA基因核苷酸序列分析结果显示HA裂解位点为PSRSSR↓GLF，具有典型LPAIV分子特征。张蔚和施一（2015）研究表明，HA受体结合位点的特异性决定了AIV感染的宿主范围。本研究发现分离毒株HA基因的第226位受体结合位点发生突变（Q→L），表明分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）存在结合哺乳动物受体的可能性。AIV受体结合特性试验结果显示，分离毒株具备与α-2，6唾液酸受体结合的特性，与其氨基酸受体位点的分析结果相符。
H9N2亚型AIV是目前威胁我国养禽业发展的主要病毒之一，且其发病及继发感染趋势越来越严重，许多家禽养殖场即使免疫了H9亚型AIV疫苗也时有AIV暴发流行，给家禽养殖业带来巨大经济损失（顾敏等，2015；张小峰等，2016）。本研究中，基于HA基因核苷酸序列的遗传进化分析结果表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于4.2.5分支，而目前国内常用的H9N2亚型AIV疫苗株如SD696株、F株和SS株等在遗传进化关系上均属于4.2.3分支（丛彦龙等，2017），二者虽同属于4.2大分支，但在遗传进化关系上两个小分支间存在明显差异，而这些差异可能导致其抗原性与疫苗株不一致，使得当前应用的疫苗无法提供100%的保护率。此外，广西毗邻AI疫情复杂的越南，同时处于全球候鸟迁徙路线上，加上当地农民普遍存在放养家禽的习惯，为AIV变异株的产生或新亚型的形成甚至流行创造了理想条件。本研究中，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与越南分离毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，推测其来源于越南的鸭子；其他6个内部基因也分别来源于不同的AIV亚型，说明该分离毒株是一株由不同亚型AIV重组产生的新病毒。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV，临床中出现的呼吸道症状、支气管栓塞及死亡情况可能是由其他病毒混合感染或继发细菌感染所引起，但具体原因有待进一步探究证实。
4 结论
从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV，是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株，可导致鸡群疫苗免疫失败，且具有感染人类的潜在风险。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 禽流感病毒（AIV）；H9N2亚型；分离鉴定；遗传进化；裂解位点；受体结合特性；广西
中图分类号： S858.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0780-07
Isolation and identification of H9N2 subtype avian influenza virus from chicken in Guangxi and its genetic evolution
ZHANG Yan-wen1，2， HE Yong-quan3， WU Yun-yue1， YU Dong-ling1，
ZENG Wen-bang1， NING Zhi-peng1
（1Nanning University， Nanning 530200， China； 2The State Key Laboratory of Virology， Wuhan 430072， China；
3 Nanning Shanfeng Agriculture and Livestock Husbandry Investment Co.， Ltd.， Nanning 530000， China）
Abstract：【Objective】This study determined molecular genetic variation regularity of H9N2 subtype avian influenza virus（AIV） and its effects on public health safety of human so as to provide reference for the prevention and control of H9 subtype avian influenza（AI）. 【Method】Suspected tissue samples were collected from one chicken farm in Guangxi， viral isolation was performed by inoculating SPF chicken embryo. The virus was preliminarily identified as H9 subtype AIV isolated strain. Then eight gene fragments isolated from H9 subtype AIV including HA，NA，PB2，PB，PA，NP，M and NS were sequenced， and their genetic evolution was analyzed. The biological characteristics of the isolated strain were also determined at the same time. 【Result】A H9N2 subtype AIV strain， named A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），was successfully separated from the sick chicken population in Guangxi. The cleavage site of HA gene in A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） was PSRSSR↓GLF， which had typical features of low pathogenic AIV（LPAIV） molecule. In genetic evolution relation，it belonged to 4.2.5 branch， and had some differences with the domestic H9N2 subtype AIV vaccine strains which belonged to 4.2.3 branch. The other seven genes were also derived from different AIV subtypes. The isolated virus strain A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2） could bind to α-2，3 sialic acid and α-2，6 sialic acid receptors， with the potential risk to infect human. Virus distribution was mainly concentrated in trachea， lung and spleen after it infected chicken， and the virus also could be released through the respiratory tract and digestive tract at same time. The virus was released from day 1 and peaked on the day 5 after the chicken was infected. 【Conclusion】A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2），isolated from Guangxi sick chicken population， belonged to LPAIV. It is a H9N2 subtype new virus created by different subtypes AIV. It can lead to the failure of chicken vaccine immunization and has the potential risk of infecting human beings. Key words：avian influenza virus（AIV）；H9N2 subtype； isolation and identification； genetic evolution； cleavage site； receptor-binding specificity； Guangxi
0 引言
【研究意义】禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类呼吸道传染病。AIV基因组由8个大小不同的基因片段组成，分别为HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS（韦平和秦爱建，2008），因其开放阅读框（ORF）的不同可编码至少12种蛋白（谭伟和谢芝勋，2014）。根据病毒表面糖蛋白（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，AIV可划分为18个HA亚型和11个NA亚型（Tong et al.，2013；Zhu et al.，2013；吴青等，2017）；而依据AIV对SPF鸡致病性的强弱，又将其分为高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）两种类型（王秀荣和陈化兰，2015）。H9N2亚型AIV属于LPAIV，但其感染鸡群后会引起免疫抑制，进而导致其他病原体感染率上升，增加发病鸡群因继发或混合感染引起的死亡率。同时，H9N2亚型AIV可直接感染人类或为其他流感病毒感染人类提供内部基因，严重威胁公共卫生安全（魏宝之，2013）。因此，加强H9N2亚型AIV遗传变异规律研究对有效防控AI具有重要意义。【前人研究进展】1994年，陈伯伦等从我国广东的发病鸡群中首次分离获得H9N2亚型AIV，随后H9N2亚型AIV在我国多个省（区）暴发和流行，给家禽养殖业带来巨大经济损失（顾敏等，2015）。H9N2亚型AIV某些特异性受体结合位点的突变可致使其跨越种属屏障而感染哺乳动物及人类（王爱荣，2015），1997年在广东和香港相继出现H9N2亚型AIV直接感染人类并表现出严重临床症状的病例（郭元吉等，1999；Peiris et al.，1999），随后大量研究证实，H9N2亚型AIV可为H10N8、H6N1、H7N9和H5N6亚型AIV感染人类时提供内部基因（Liu et al.，2013，2014；Chen et al.，2014；Xu et al.，2016）。近年来，国内外学者对H9N2亚型AIV流行病学及其遗传变异情况进行深入研究分析，发现该亚型病毒的HA基因变异速率在不断加快，且其内部基因的构成及来源也越来越复杂，导致疫苗免疫失败及人类感染事件时有发生（孟芳等，2016；杨均等，2016；张静等，2016；Wei et al.，2016；Pan et al.，2017）。【本研究切入点】目前，关于广西H9N2亚型AIV流行病学及其基因组测序的研究已有报道（谢芝勋等，2007；屈素洁等，2016），但针对该亚型病毒尤其是鸡源H9N2亚型AIV在广西地区遗传变异的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从呈现呼吸道症状的肉鸡群中采集病料，经SPF鸡胚接种进行病毒分离，对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆，并通过测序分析和构建遗传进化树，明确广西鸡源H9N2亚型AIV的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响，进而为H9亚型AI的防控提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2016年广西某肉鸡养殖场35日龄的三黄鸡群疑似感染AIV，患病肉鸡主要表现为呼吸道症状，剖检发现其腺胃乳头凹凸不平，个别乳头有出血点，支气管有干酪样栓塞。该鸡群在12日龄时进行过H9亚型AIV灭活苗免疫。病毒分离材料为发病鸡的肺脏和支气管；SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物有限公司提供种蛋，自行孵化；H9亚型AI HA抗原和HI特异性抗体购自哈尔滨维科生物技术开发公司；One Step RT-PCR Kit、pMD18-T载体、α-2，3唾液酸酶和DNA Marker购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒、DNA纯化/回收试剂盒购和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；1%绵羊红细胞和1%鸡红细胞由病毒学国家重点实验室自行制备，其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 病毒分离纯化及鉴定
将具有明显病变的肺脏和支气管病料样品按比例加入生理盐水进行研磨，反复冻融3次后8000 r/min离心5 min，取其上清液用0.22 μm一次性滤器进行过滤。采用尿囊腔接种方式将上清液接种至9日龄SPF鸡胚中，37 ℃孵育观察96 h，收集死亡和未死亡鸡胚的尿囊液，分别以血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）鉴定病毒增殖效果。其中，HI试验结果呈阳性的样品参照仇保丰等（2010）的方法，通过有限稀释法进行连续3轮的克隆纯化，纯化后的样品增殖培养并超速离心后，-80 ℃保存备用。
1. 3 基因组RT-PCR扩增及测序
使用RNA提取试剂盒提取鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA，同时参照Hoffmann等（2001）的方法合成扩增引物，并按照One Step RT-PCR Kit試剂盒说明采用一步法扩增病毒基因组的8个基因片段；所得PCR产物经切胶纯化，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，经扩大培养后挑取单个菌落进行PCR鉴定，鉴定结果呈阳性的菌液送至深圳华大基因公司进行测序。
1. 4 基因组遗传进化分析
应用DNASTAR对各基因片段的测序结果进行比对分析，将整理后正确的核苷酸序列以MEGA 7.0中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree绘制遗传进化树，分析其遗传进化关系。
1. 5 AIV受体结合特性测定 采用红细胞法测定AIV受体结合特性（屈亚锦等，2013），即采用经α-2，3唾液酸酶处理的1%鸡红细胞、1%绵羊红细胞及1%鸡红细胞分别对待测病毒进行HA试验，然后根据待测病毒与上述不同红细胞结合特性的差异判定其受体亲和性及是否存在感染人类的潜在可能性。
1. 6 病毒感染性试验
将30羽4周龄的健康非免疫鸡随机平均分成两组，其中一组作为空白对照组，另一组为感染组，即将AIV分离株鸡胚尿囊液稀释至106 EID50/100 μL，经静脉注射感染试验鸡（100 μL/羽）。病毒感染后连续观察记录试验鸡的临床症状，并分别于攻毒后第1、3、5、7、9、11和14 d采集对照组和感染组试验鸡的咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离，检测病毒感染试验鸡后的排毒情况；同时在攻毒后第3 d每组随机剖检3羽试验鸡，采集其气管、肺脏、心脏、脾脏、盲肠扁桃体、肾脏和肝脏等器官组织进行病毒滴定试验。攻毒后第14 d剖杀所有存活试验鸡并剖检观察其病变，然后综合上述试验结果评价该病毒分离株对鸡的致病性及病毒的复制和排毒情况。
2 结果与分析
2. 1 病毒分离及HA亚型血清学鉴定结果
利用SPF鸡胚进行病毒分离，并对HA效价≥5log2的鸡胚尿囊液进行HI试验，其血清学鉴定结果表明分离获得一株抗H9阳性血清且HI效价为6log2的AIV。
2. 2 病毒纯化结果
采用有限稀释法对AIV分离株进行克隆纯化，通过连续3代的纯化得到抗H9阳性血清且HI效价为9log2的毒株。将第4代鸡胚尿囊液以低速离心机离心后取上清液再进行超速离心（40000 r/min离心4 h），弃上清液，其沉淀用1 mL灭菌生理盐水悬浮后保存备用。
2. 3 病毒全基因RT-PCR扩增及测序结果
分离毒株经RT-PCR扩增均可获得与预期结果相符的8个目的基因条带（图1）。试剂盒回收各基因扩增目的片段，连接至pMD18-T载体后转化DH5α感受态细胞，进行扩大培养，将PCR鉴定呈阳性的菌液送至深圳华大基因公司进行测序，根据DNASTAR测序结果进行比对拼接，并登陆NCBI进行基因同源性BLAST比对分析，结果发现HA和NA基因测序结果与H9N2亚型AIV的核苷酸同源性最高，分别为99%和98%；其余6个内部基因则与GenBank中其他AIV相应基因核苷酸序列高度同源（表1）。综合其血清学鉴定结果，将该分离毒株命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）。
2. 4 基因组遗传进化分析结果
分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）HA基因ORF为1683 bp，编码560个氨基酸，与参考毒株（常见进化分支的代表性毒株）进行比对分析未发现有碱基插入或缺失。HA基因可被蛋白酶裂解成HA1和HA2两个编码区，分别编码321和221个氨基酸，HA裂解位点为PSRSSR↓GLF，该特征为典型的LPAIV分子特征。HA受体结合位点的第226位（参照H3亚型编号）氨基酸如发生突变（Q→L），则表明该病毒对人流感病毒受体SAα-2，6的识别能力提高。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与越南分离毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，与目前国内常用H9N2亚型AIV疫苗株的同源性却在95%以下。基于HA基因核苷酸序列的遗传进化分析结果也表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于4.2.5分支，与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所处的4.2.3分支属于不同小分支，存在一定差异（图2）。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）NA基因ORF为1401 bp，编码466个氨基酸，与广西分离毒株A/turtledove/Guangxi/49B6/2013（H9N2）的NA基因核苷酸同源性在98%以上，处在同一分支上（图3）。其他6个内部基因（PB1、PB2、PA、NP、M和NS）的编码区长度分别为2274、2280、2151、1497、982和828 bp，依据其对应的核苷酸序列分别构建遗传进化树，结果显示分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与广西周边地区和国家的分离毒株亲缘关系密切，處于欧亚分支上，与北美分离毒株的亲缘关系较远且处在不同分支上。进一步的序列比对分析结果表明，这些内部基因分别与H9N2、H7N9、H6N2和H10N8等亚型AIV相应基因核苷酸序列存在较高的同源性，说明其内部基因可能来源于上述参考毒株，也提示分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）的内部基因来源关系较复杂。
2. 5 AIV受体结合特性分析结果
因含不同受体的AIV与不同动物红细胞的结合能力也不同，故采用常规HA试验测定其受体结合特性。以只含α-2，6唾液酸受体的绵羊红细胞和经α-2，3唾液酸处理的鸡红细胞分别与待测分离毒株进行HA试验，结果表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与含有α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受体的红细胞均能结合，但与含α-2，6唾液酸受体红细胞的结合能力更强，说明该分离毒株同时具备与α-2，3唾液酸和α-2，6唾液酸受体结合的特性，且具有感染人类的潜在风险。
2. 6 病毒感染性试验结果
感染组的15羽健康非免疫鸡在攻毒后均未表现出明显的临床症状和死亡情况，说明分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV。攻毒后第3 d剖检，仅发现气管充血并有少量黏液，腺胃内黏液增多，其他脏器均未见明显病变。各脏器病毒滴定结果表明，病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏（表2）。咽喉和泄殖腔棉拭子病毒检测结果显示，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）可通过呼吸道和消化道同时排毒，且在攻毒后第1 d即开始排毒，第5 d为排毒高峰。 3 讨论
本研究从广西发病鸡群中分离获得一株H9亚型AIV[A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）]，其HA试验结果显示该分离毒株具有直接凝集鸡红细胞的特性，而HI试验结果显示该分离毒株只能被H9亚型AIV标准阳性血清所抑制，即血清学鉴定结果初步证实该分离毒株为H9亚型AIV。同时对分离毒株的8个基因进行克隆及测序分析，其中，HA基因核苷酸序列分析结果显示HA裂解位点为PSRSSR↓GLF，具有典型LPAIV分子特征。张蔚和施一（2015）研究表明，HA受体结合位点的特异性决定了AIV感染的宿主范围。本研究发现分离毒株HA基因的第226位受体结合位点发生突变（Q→L），表明分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）存在结合哺乳动物受体的可能性。AIV受体结合特性试验结果显示，分离毒株具备与α-2，6唾液酸受体结合的特性，与其氨基酸受体位点的分析结果相符。
H9N2亚型AIV是目前威胁我国养禽业发展的主要病毒之一，且其发病及继发感染趋势越来越严重，许多家禽养殖场即使免疫了H9亚型AIV疫苗也时有AIV暴发流行，给家禽养殖业带来巨大经济损失（顾敏等，2015；张小峰等，2016）。本研究中，基于HA基因核苷酸序列的遗传进化分析结果表明，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于4.2.5分支，而目前国内常用的H9N2亚型AIV疫苗株如SD696株、F株和SS株等在遗传进化关系上均属于4.2.3分支（丛彦龙等，2017），二者虽同属于4.2大分支，但在遗传进化关系上两个小分支间存在明显差异，而这些差异可能导致其抗原性与疫苗株不一致，使得当前应用的疫苗无法提供100%的保护率。此外，广西毗邻AI疫情复杂的越南，同时处于全球候鸟迁徙路线上，加上当地农民普遍存在放养家禽的习惯，为AIV变异株的产生或新亚型的形成甚至流行创造了理想条件。本研究中，分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）与越南分离毒株A/muscovy duck/Quang Ninh/132/2013（H9N6）的HA基因核苷酸同源性在99%以上，推测其来源于越南的鸭子；其他6个内部基因也分别来源于不同的AIV亚型，说明该分离毒株是一株由不同亚型AIV重组产生的新病毒。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV，临床中出现的呼吸道症状、支气管栓塞及死亡情况可能是由其他病毒混合感染或继发细菌感染所引起，但具体原因有待进一步探究证实。
4 结论
从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016（H9N2）属于LPAIV，是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株，可导致鸡群疫苗免疫失败，且具有感染人类的潜在风险。
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（責任编辑 兰宗宝）