【摘 要】
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目的克隆艰难梭菌毒素C(tcdC)基因并构建TcdC蛋白的原核表达载体,制备多克隆抗体。方法从艰难梭菌标准株(ATCC43255)基因组DNA中扩增获得tcdC基因的部分片段,连接到原核表达
【机 构】
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河北大学生命科学学院,军事医学科学院基础医学研究所,浙江省疾病预防控制中心
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目的克隆艰难梭菌毒素C(tcdC)基因并构建TcdC蛋白的原核表达载体,制备多克隆抗体。方法从艰难梭菌标准株(ATCC43255)基因组DNA中扩增获得tcdC基因的部分片段,连接到原核表达载体并转化到大肠杆菌中,诱导表达GST-TcdC/L和IL1-TcdC/L融合蛋白,前者用作免疫抗原,后者用作检测抗原。采用SDS-PAGE法鉴定融合蛋白的表达,并通过Ni柱纯化IL1-TcdC/L融合蛋白,Q柱纯化GST-TcdC/L融合蛋白。将纯化的GST-TcdC/L融合蛋白于兔背部皮内多点注射,每只1 mg,4周1次,共3次。最后1次免疫后2周,采血分离血清。用IL1-TcdC/L蛋白包被酶联板,采用ELISA法检测多抗血清效价;Western蛋白印迹法检测多抗特异性,结果 SDS-PAGE结果表明,所表达的2个融合蛋白与预期分子质量一致。ELISA结果显示,制备的TcdC多克隆抗体效价>1:6.4×10~4。Western蛋白印迹实验显示,制备的TcdC/L多克隆抗体能特异性识别艰难梭菌中的TcdC蛋白。结论成功克隆了艰难梭菌tcdC/L基因并进行了原核表达,成功制备了其多克隆抗体,为后续研究tcdC基因在艰难梭菌致病过程中的作用及机制奠定了基础。
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