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摘要[目的]探索豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。[方法]在超声辅助和单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化得到豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。[结果]豆腐柴总黄酮最佳提取工艺为∶液料比为40∶1（mL/g），乙醇体积分数为70%，超声温度为70 ℃，提取时间为30 min。在此条件下，豆腐柴总黄酮提取率为83.1 mg/g。[结论]正交试验优化超声提取工艺能够显著提高豆腐柴总黄酮的提取率。
关键词豆腐柴；总黄酮；正交试验；工艺优化
中图分类号R284.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）18-132-02
Abstract[Objective] To optimize the extraction techniques using for extracting total flavonoids from Premna microphylla Turcz. [Method] On the basis of ultrasound assisted and single factor test，the optimal extraction technique was obtained through three factors and three levels orthogonal test. [Result] The optimal extraction conditions were obtained as following： using 70% ethanol with a solid/liquid ratio of 40∶1 mL/g and extraction at 70 ℃ for 30 min. Under the above conditions，83.1 mg/g flavonoids could be extracted from Premna microphylla. [Conclusion] The orthogonal test optimal ultrasoundassisted extraction technique can significantly improve the yield of total flavonoids from Premna microphylla.
Key wordsPremna microphylla Turcz； Total flavonoids； Orthogonal test； Technique optimization
豆腐柴（Premna microphylla Turcz）学名腐婢，又叫观音草、 臭常山、 满山香和铁箍散等，在我国主要分布于长江流域以南，其根、茎、叶均可入药[1]。豆腐柴含有丰富的对人体有益的物质，如果胶、蛋白质、纤维素和过氧化物酶、黄酮类等，黄酮类化合物具有调节血脂、消除氧自由基、消除炎症、抗肿瘤、预防紫外线损伤等多种生理活性[2-4]。豆腐柴作为一种药食两用植物，利用历史悠久，作为食品、药品、保健品均具有较高的开发利用价值[5]，研究发现豆腐柴叶中总黄酮的提取率为6%[6]。该试验在超声辅助、单因素试验基础上，采用正交试验对豆腐柴中总黄酮提取工艺进行优化。
1材料与方法
1.1试材
豆腐柴，采摘自浙江省浦江县仙华山，除杂、清洗、干燥、粉碎、过100目筛，密封储存于4 ℃冰箱。
槲皮素（北京索莱宝生物技术有限公司）；甲醇、无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化铝，均为分析纯。
1.2仪器BL3-120C超声清洗器（上海比朗仪器有限公司）；BS224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Spectrumlab755s紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。
1.3方法
1.3.1豆腐柴总黄酮的超声辅助提取。
精确称量0.2 g豆腐柴，加入一定比例的提取溶剂，在不同条件下超声辅助提取总黄酮，抽滤后取滤液，用蒸馏水定容至25 mL。
1.3.2总黄酮的测定。
采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[7]，稍作改动。以槲皮素为标样制作标准曲线，精确称取3 mg的槲皮素，甲醇溶解并定容至10 mL，配成浓度为300 μg/mL的标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于试管中，加入600 μL蒸馏水、300 μL 5%亚硝酸钠，振摇，并在暗处反应6 min，加入600 μL 10%三氯化铝，振摇，在暗处反应5 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至5.6 mL，在755 nm处测吸光度值。得到槲皮素质量浓度ρ（μg/mL）与吸光度x的回归方程为ρ=0.001 64x-0.019 33，R2=0.992 9（图1）。用同样方法测定待测定豆腐柴提取液的吸光度。
总黄酮提取率的计算公式为M=C×N/（m×V×1 000），式中，M为豆腐柴中总黄酮的含量（mg/g）；C为根据标准曲线计算出的待测液的总黄酮含量（μg）；V为待测液体积（mL）；m为豆腐柴的质量（g）；N为豆腐柴提取液的体积（mL）；1 000为换算倍数。
1.3.3单因素试验。
1.3.3.1液料比对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min的条件下，分别采用液料比20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1（mL/g）的体积分数为70%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察液料比对总黄酮提取率的影响。
1.3.3.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min、液料比60∶1的条件下，分别采用体积分数20%、40%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。 1.3.3.3提取温度对总黄酮提取率的影响。在乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下超声提取20 min，考察提取温度对总黄酮提取率的影响。
1.3.3.4提取时间对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别提取10、20、30、40、50 min，考察提取时间对总黄酮提取率的影响。
1.3.4正交设计优化工艺。
在单因素试验基础上，固定液料比40∶1，以提取温度（A）、提取时间（B）、乙醇体积分数（C）为考察因素，采用L9（34）正交试验优化豆腐柴总黄酮提取工艺（表1）。
1.4数据处理数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析， P<0.05为统计学显著差异的标准。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1液料比对总黄酮提取率的影响。
由图2可知，总黄酮提取率随着料液比的增大先增加后逐渐趋于平缓，可能是因为总黄酮的浸出量已经达到饱和。从节约溶剂方面考虑，将液料比确定为40∶1。
2.1.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。
由图3可知，随乙醇体积分数的增加，豆腐柴总黄酮提取率先增加后下降，当乙醇体积分数达70%时，总黄酮提取率达最大值（76.3 mg/g）。因此确定总黄酮的最佳提取乙醇体积分数为70%。
2.1.3提取温度对总黄酮提取率的影响。
由图4可知，随着超声温度的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取温度达70 ℃时，总黄酮提取率达最大值（78.5 mg/g）。因此确定豆腐柴的最佳提取温度为70 ℃。
2.1.4提取时间对总黄酮提取率的影响。
由图5可知，随着提取时间的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取时间达30 min时，总黄酮提取率达最大值（82.0 mg/g）。因此确定豆腐柴总黄酮的最佳提取时间为30 min。
2.2正交试验从表2可以看出，各因素对总黄酮提取率影响顺序从大到小依次为C、B、A，且方差分析发现，C有极显著性影响（P<0.01），B、A有显著影响（P<0.05），即乙醇体积分数对豆腐柴总黄酮提取率的影响最大，其次是提取时间、超声温度。从提取率和节约原料方面考虑，豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺为A2B2C2，即液料比40∶1、乙醇体积分数为70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。
2.3验证试验为进一步验证正交试验结果的可靠性和重复性，按照所得最佳条件做了3次平行试验。结果表明，使用该方法优化出了超声辅助豆腐柴总黄酮的最佳工艺条件，在该条件下总黄酮提取率为83.1 mg/g，不但提取率高，且试验的重现性好。
3结论
该研究在超声辅助和单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，豆腐柴总黄酮最佳提取工艺为液料比40∶1（ mL/g）、乙醇体积分数70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。在此条件下，豆腐柴总黄酮提取率为83.1 mg/g。
参考文献
[1]
汪海斌，王燕燕. 豆腐柴有效成分及药理作用[J].医药导报，2015，34（4）：492-494.
[2] 张强，赵新淮.总黄酮和总黄酮醇诱导人食管癌细胞周期停滞的分子机制[J].生物化学与生物物理进展，2008（9）：1031-1038.
[3] KESHARI A K，KUMAR G，KUSHWAHA P S，et al.Isolated flavonoids from Ficus racemosa stem bark possess antidiabetic，hypolipidemic and protective effects in albino Wistar rats[J].Journal of ethnopharmacology，2016，181：252-262.
[4] AMBRIZ-PEREZ D L，BANG W Y，NAIR V，et al.Protective role of flavonoids and lipophilic compounds from jatropha platyphylla on the suppression of Lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammation in macrophage cells[J].Journal of agricultural and food chemistry，2016，64（9）：1899-1909.
[5] 高燕妮，路峰，高昂，等.豆腐柴药学研究概况[J].安徽农业科学，2011，39（32）：19811-19812.
[6] 曹稳根，段红，翟科峰，等.正交试验优选豆腐柴叶总黄酮的微波提取工艺[J].光谱实验室，2013，30（5）：2174-2177.
[7] MOUZA K N，AL-GHUDANI，MOHAMMAD A H.Determination of total phenolics，flavonoids and antioxidant activity of root crude extracts of Adenium obesum traditionally used for the treatment of bone dislocations and rheumatism[J].Asian pacific journal of tropical disease，2015，5（S1）：155-158.
关键词豆腐柴；总黄酮；正交试验；工艺优化
中图分类号R284.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）18-132-02
Abstract[Objective] To optimize the extraction techniques using for extracting total flavonoids from Premna microphylla Turcz. [Method] On the basis of ultrasound assisted and single factor test，the optimal extraction technique was obtained through three factors and three levels orthogonal test. [Result] The optimal extraction conditions were obtained as following： using 70% ethanol with a solid/liquid ratio of 40∶1 mL/g and extraction at 70 ℃ for 30 min. Under the above conditions，83.1 mg/g flavonoids could be extracted from Premna microphylla. [Conclusion] The orthogonal test optimal ultrasoundassisted extraction technique can significantly improve the yield of total flavonoids from Premna microphylla.
Key wordsPremna microphylla Turcz； Total flavonoids； Orthogonal test； Technique optimization
豆腐柴（Premna microphylla Turcz）学名腐婢，又叫观音草、 臭常山、 满山香和铁箍散等，在我国主要分布于长江流域以南，其根、茎、叶均可入药[1]。豆腐柴含有丰富的对人体有益的物质，如果胶、蛋白质、纤维素和过氧化物酶、黄酮类等，黄酮类化合物具有调节血脂、消除氧自由基、消除炎症、抗肿瘤、预防紫外线损伤等多种生理活性[2-4]。豆腐柴作为一种药食两用植物，利用历史悠久，作为食品、药品、保健品均具有较高的开发利用价值[5]，研究发现豆腐柴叶中总黄酮的提取率为6%[6]。该试验在超声辅助、单因素试验基础上，采用正交试验对豆腐柴中总黄酮提取工艺进行优化。
1材料与方法
1.1试材
豆腐柴，采摘自浙江省浦江县仙华山，除杂、清洗、干燥、粉碎、过100目筛，密封储存于4 ℃冰箱。
槲皮素（北京索莱宝生物技术有限公司）；甲醇、无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化铝，均为分析纯。
1.2仪器BL3-120C超声清洗器（上海比朗仪器有限公司）；BS224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Spectrumlab755s紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。
1.3方法
1.3.1豆腐柴总黄酮的超声辅助提取。
精确称量0.2 g豆腐柴，加入一定比例的提取溶剂，在不同条件下超声辅助提取总黄酮，抽滤后取滤液，用蒸馏水定容至25 mL。
1.3.2总黄酮的测定。
采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[7]，稍作改动。以槲皮素为标样制作标准曲线，精确称取3 mg的槲皮素，甲醇溶解并定容至10 mL，配成浓度为300 μg/mL的标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于试管中，加入600 μL蒸馏水、300 μL 5%亚硝酸钠，振摇，并在暗处反应6 min，加入600 μL 10%三氯化铝，振摇，在暗处反应5 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至5.6 mL，在755 nm处测吸光度值。得到槲皮素质量浓度ρ（μg/mL）与吸光度x的回归方程为ρ=0.001 64x-0.019 33，R2=0.992 9（图1）。用同样方法测定待测定豆腐柴提取液的吸光度。
总黄酮提取率的计算公式为M=C×N/（m×V×1 000），式中，M为豆腐柴中总黄酮的含量（mg/g）；C为根据标准曲线计算出的待测液的总黄酮含量（μg）；V为待测液体积（mL）；m为豆腐柴的质量（g）；N为豆腐柴提取液的体积（mL）；1 000为换算倍数。
1.3.3单因素试验。
1.3.3.1液料比对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min的条件下，分别采用液料比20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1（mL/g）的体积分数为70%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察液料比对总黄酮提取率的影响。
1.3.3.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min、液料比60∶1的条件下，分别采用体积分数20%、40%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。 1.3.3.3提取温度对总黄酮提取率的影响。在乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下超声提取20 min，考察提取温度对总黄酮提取率的影响。
1.3.3.4提取时间对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别提取10、20、30、40、50 min，考察提取时间对总黄酮提取率的影响。
1.3.4正交设计优化工艺。
在单因素试验基础上，固定液料比40∶1，以提取温度（A）、提取时间（B）、乙醇体积分数（C）为考察因素，采用L9（34）正交试验优化豆腐柴总黄酮提取工艺（表1）。
1.4数据处理数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析， P<0.05为统计学显著差异的标准。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1液料比对总黄酮提取率的影响。
由图2可知，总黄酮提取率随着料液比的增大先增加后逐渐趋于平缓，可能是因为总黄酮的浸出量已经达到饱和。从节约溶剂方面考虑，将液料比确定为40∶1。
2.1.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。
由图3可知，随乙醇体积分数的增加，豆腐柴总黄酮提取率先增加后下降，当乙醇体积分数达70%时，总黄酮提取率达最大值（76.3 mg/g）。因此确定总黄酮的最佳提取乙醇体积分数为70%。
2.1.3提取温度对总黄酮提取率的影响。
由图4可知，随着超声温度的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取温度达70 ℃时，总黄酮提取率达最大值（78.5 mg/g）。因此确定豆腐柴的最佳提取温度为70 ℃。
2.1.4提取时间对总黄酮提取率的影响。
由图5可知，随着提取时间的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取时间达30 min时，总黄酮提取率达最大值（82.0 mg/g）。因此确定豆腐柴总黄酮的最佳提取时间为30 min。
2.2正交试验从表2可以看出，各因素对总黄酮提取率影响顺序从大到小依次为C、B、A，且方差分析发现，C有极显著性影响（P<0.01），B、A有显著影响（P<0.05），即乙醇体积分数对豆腐柴总黄酮提取率的影响最大，其次是提取时间、超声温度。从提取率和节约原料方面考虑，豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺为A2B2C2，即液料比40∶1、乙醇体积分数为70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。
2.3验证试验为进一步验证正交试验结果的可靠性和重复性，按照所得最佳条件做了3次平行试验。结果表明，使用该方法优化出了超声辅助豆腐柴总黄酮的最佳工艺条件，在该条件下总黄酮提取率为83.1 mg/g，不但提取率高，且试验的重现性好。
3结论
该研究在超声辅助和单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，豆腐柴总黄酮最佳提取工艺为液料比40∶1（ mL/g）、乙醇体积分数70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。在此条件下，豆腐柴总黄酮提取率为83.1 mg/g。
参考文献
[1]
汪海斌，王燕燕. 豆腐柴有效成分及药理作用[J].医药导报，2015，34（4）：492-494.
[2] 张强，赵新淮.总黄酮和总黄酮醇诱导人食管癌细胞周期停滞的分子机制[J].生物化学与生物物理进展，2008（9）：1031-1038.
[3] KESHARI A K，KUMAR G，KUSHWAHA P S，et al.Isolated flavonoids from Ficus racemosa stem bark possess antidiabetic，hypolipidemic and protective effects in albino Wistar rats[J].Journal of ethnopharmacology，2016，181：252-262.
[4] AMBRIZ-PEREZ D L，BANG W Y，NAIR V，et al.Protective role of flavonoids and lipophilic compounds from jatropha platyphylla on the suppression of Lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammation in macrophage cells[J].Journal of agricultural and food chemistry，2016，64（9）：1899-1909.
[5] 高燕妮，路峰，高昂，等.豆腐柴药学研究概况[J].安徽农业科学，2011，39（32）：19811-19812.
[6] 曹稳根，段红，翟科峰，等.正交试验优选豆腐柴叶总黄酮的微波提取工艺[J].光谱实验室，2013，30（5）：2174-2177.
[7] MOUZA K N，AL-GHUDANI，MOHAMMAD A H.Determination of total phenolics，flavonoids and antioxidant activity of root crude extracts of Adenium obesum traditionally used for the treatment of bone dislocations and rheumatism[J].Asian pacific journal of tropical disease，2015，5（S1）：155-158.