【摘 要】
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目的 构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应.方法 根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形
【机 构】
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太原,华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科
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目的 构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应.方法 根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1,酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2.通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞,确定转染效率;通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测Pik3cb mRNA的表达;TUNEL法检测细胞凋亡.结果 pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同,转染大鼠平滑肌细胞48 h时转染率为15.7%,荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),错配质粒组与对照组比较Pik3cb mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb-shRNA,并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达,为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础.
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