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[摘 要]以往的动物病理切片的制作都是依靠经典石蜡切片技术来进行的，本文将在此基础上阐述一种更加便捷、效果更好的切片制作方法，并对改良前后的制作结果进行了对比、分析，以供参考。
[关键词]动物；病理组织切片；制作方法；改良
中图分类号：TH503 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）32-0000-01
引言
随着生物技术和医学的发展，以及光学仪器和切片机的日益精密，切片技术已经成为病理形态学，乃至生物形态学及定性研究中不可缺少的组成部分。病理切片对于兽医疾病诊断起着重要的作用，高质量的病理切片对疾病性质的判断特别是肿瘤良恶性判断起着非常关键的作用。本文所讲的切片制作技术是纯手工操作，而且对切片制作的每个环节都进行了改良。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
以猪瘟为例，切取肺脏、肾脏、心脏组织数块。
1.1.2 仪器
SK生物组织快速处理仪为上海隆拓仪器设备有限公司产品；KD-3368-VI电脑冷冻石蜡两用切片机为浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；OLYMPUSCHC型光学显微镜为日本O-LYMPUS光学工业株式会社产品；MD90数码成像装置为广州明美科技有限公司产品。
1.2 方法
为对比快捷石蜡切片制作方法与传统石蜡切片制作方法和冰冻切片之间的差异，试验分为快捷石蜡切片组，传统石蜡切片组和冰冻切片组3组，采用不同方法进行制作对比。石蜡切片厚度均为5μm，为保证冰冻切片完整性，切片厚度为25μm；各组切片均在相同条件下进行HE染色。切片染色后运用OLYMPUSCHC型光学显微镜和MD90数码成像装置进行观察与摄片。
1.2.1 传统石蜡切片组
第一，取心脏、肾脏病理组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，将病料分别放入75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度脱水各1h；第二，放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1h进行透明；第三，分别放入54摄氏度石蜡浸蜡1h，石蜡浸蜡1h；第四，56℃～58℃石蜡包埋，室温冷却、切片；第五，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各2min；100%、95%、85%、75%浓度梯度酒精复水各1min；第六，苏木素染色5分钟，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色2分钟，水洗2次；85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各1min，二甲苯透明2分钟；第六，中性樹胶封片、镜检。
1.2.2 快捷石蜡切片组
第一，准备100ml具塞广口瓶6个，分别盛入AF固定液、85%酒精、95%酒精、100%正丁醇、混合石蜡（硬脂酸与54℃石蜡按1：3混合）；第二，取心脏、肾脏病理组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，放入100ml具塞广口瓶，置于SK生物组织快速处理仪中超声处理（水温75℃，超声频率1MHz，超声时间根据组织大小选择3～5分钟），依次完成固定、脱水、透明、浸蜡；第三，56℃～58℃石蜡包埋、冰箱2℃迅速冷却、切片；第四，100%正丁醇脱蜡3分钟；100%、95%、85%、75%浓度梯度酒精复水各1分钟；第五，苏木素染色2分钟，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色2分钟，水洗2次；85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各1分钟，100%正丁醇透明2分钟；第六，中性树胶封片、镜检。
1.2.3 冰冻切片组
第一，取病料切成1.0cm×1.0cm×0.5cm大小，置于组织支承器上，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冷冻15～35min；第二，组织冻结后，行25微米厚度切片，贴附于洁净玻片上待染色；第三，切片AF液固定30s，水洗1次；第四，苏木素（60摄氏度）染色1min，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色1分钟，水洗2次；第五，85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各10s，二甲苯透明30s；第六，中性树胶封片、镜检。
2、结果
2.1传统石蜡切片组
经过研究发现，传统石蜡切片组病理组织块经过脱水、透明、浸蜡等环节后，外形会发生明显的收缩变化；假若上述操作的时间不合理，就非常容易出现组织过硬和切片易碎的现象；此组病理切片经HE染色后着色好，细胞质与细胞核有明显的红蓝对比，红细胞、纤维蛋白等物质着色良好；细胞没有变形、空泡化等异常现象；切片制作花费了大概36个小时。
2.2 快捷石蜡切片组
快捷石蜡切片组病理组织块经过脱水、透明、浸蜡等环节后，体积没有发生明显的变化，光镜下观察染色后的切片发现，细胞体积比传统石蜡组的要大；该方法处理的组织块硬度适中，切片时不容易产生碎片；切片HE染色着色好，细胞质与细胞核有着明显的红蓝对比，红细胞、纤维蛋白等物质着色良好；细胞无变形、空泡化等异常现象；整个的切片制作要花费约半小时的时间。
2.3 冰冻切片组
冰冻切片组病理切片质量受冷冻时间、温度、是否速冻等因素的影响较大；切片易干涸，染色时易脱落，不利于批量染色；切片HE染色镜下细胞核与细胞质对比较明显；切片较厚，欠清晰；整个切片制作大概要花费20-40分钟。
3、讨论
在此次试验中选用的脱水剂是低毒类试剂正丁醇，用此处理组织时能够有效减少组织收缩和硬化等问题的出现。而且，由于二甲苯易于挥发，毒性很大，对切片会产生不同程度的损害，所以正丁醇还可以替代二甲苯作为透明剂。在透明时选用硬脂酸和石蜡混合液置于恒温超声波仪中代替二甲苯，这样正丁醇和硬脂酸的配合使用会提高透明效果，缩短透明时间，且正丁醇能够溶解硬脂酸带入到组织之中的多余脂肪。
另外，脱水、透明、浸蜡选用具塞广口瓶，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底，有害气体的挥发造成人员健康伤害等现象。包埋后，石蜡的迅速冷却也很重要，选择冰箱4℃迅速冷却可以有效防止包埋块中产生结晶以造成切片时引起碎裂等现象的发生。
由于冰冻切片设备价格昂贵，很多实验室的能力不足以承担这些费用。而快捷石蜡切片制作法成本低，花费的时间段，也节省了很大的人力，所以此方法值得推广和应用。
结束语
综上所述，研究者要想制备一张清晰、有效的动物病理组织切片，就应该处理好每个细节，并善于发现问题、及时解决问题。而且先进的科学技术能够让切片的制作更加便捷、高效，如超声波在切片制作过程中的应用使整个制片时间由36h缩短到30min，所以说，动物病理切片的制作需要不断更新方法，从而为后续的实验研究奠定基础。
参考文献
[1] 李慧.病理组织石蜡切片制作体会及常见问题解析[J].临床与实验病理学杂志，2014，07：811-812.
[2] 孙岩.病理组织切片染色中的常見问题及解决方法[J].中国医药指南，2013，28：578-579.
[3] 党占翠，赵忠智，于守鸿，郑谊，张爱萍，王梅，魏绍振，赵小龙，杨永海.鼠疫实验动物病理切片制作方法的建立[J].河南预防医学杂志，2015，03：182-183.
[关键词]动物；病理组织切片；制作方法；改良
中图分类号：TH503 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）32-0000-01
引言
随着生物技术和医学的发展，以及光学仪器和切片机的日益精密，切片技术已经成为病理形态学，乃至生物形态学及定性研究中不可缺少的组成部分。病理切片对于兽医疾病诊断起着重要的作用，高质量的病理切片对疾病性质的判断特别是肿瘤良恶性判断起着非常关键的作用。本文所讲的切片制作技术是纯手工操作，而且对切片制作的每个环节都进行了改良。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
以猪瘟为例，切取肺脏、肾脏、心脏组织数块。
1.1.2 仪器
SK生物组织快速处理仪为上海隆拓仪器设备有限公司产品；KD-3368-VI电脑冷冻石蜡两用切片机为浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；OLYMPUSCHC型光学显微镜为日本O-LYMPUS光学工业株式会社产品；MD90数码成像装置为广州明美科技有限公司产品。
1.2 方法
为对比快捷石蜡切片制作方法与传统石蜡切片制作方法和冰冻切片之间的差异，试验分为快捷石蜡切片组，传统石蜡切片组和冰冻切片组3组，采用不同方法进行制作对比。石蜡切片厚度均为5μm，为保证冰冻切片完整性，切片厚度为25μm；各组切片均在相同条件下进行HE染色。切片染色后运用OLYMPUSCHC型光学显微镜和MD90数码成像装置进行观察与摄片。
1.2.1 传统石蜡切片组
第一，取心脏、肾脏病理组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，将病料分别放入75%、85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度脱水各1h；第二，放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1h进行透明；第三，分别放入54摄氏度石蜡浸蜡1h，石蜡浸蜡1h；第四，56℃～58℃石蜡包埋，室温冷却、切片；第五，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各2min；100%、95%、85%、75%浓度梯度酒精复水各1min；第六，苏木素染色5分钟，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色2分钟，水洗2次；85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各1min，二甲苯透明2分钟；第六，中性樹胶封片、镜检。
1.2.2 快捷石蜡切片组
第一，准备100ml具塞广口瓶6个，分别盛入AF固定液、85%酒精、95%酒精、100%正丁醇、混合石蜡（硬脂酸与54℃石蜡按1：3混合）；第二，取心脏、肾脏病理组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，放入100ml具塞广口瓶，置于SK生物组织快速处理仪中超声处理（水温75℃，超声频率1MHz，超声时间根据组织大小选择3～5分钟），依次完成固定、脱水、透明、浸蜡；第三，56℃～58℃石蜡包埋、冰箱2℃迅速冷却、切片；第四，100%正丁醇脱蜡3分钟；100%、95%、85%、75%浓度梯度酒精复水各1分钟；第五，苏木素染色2分钟，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色2分钟，水洗2次；85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各1分钟，100%正丁醇透明2分钟；第六，中性树胶封片、镜检。
1.2.3 冰冻切片组
第一，取病料切成1.0cm×1.0cm×0.5cm大小，置于组织支承器上，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冷冻15～35min；第二，组织冻结后，行25微米厚度切片，贴附于洁净玻片上待染色；第三，切片AF液固定30s，水洗1次；第四，苏木素（60摄氏度）染色1min，水洗2次；1%盐酸酒精分化5s，水洗2次；伊红染色1分钟，水洗2次；第五，85%、95%、100%浓度酒精梯度脱水各10s，二甲苯透明30s；第六，中性树胶封片、镜检。
2、结果
2.1传统石蜡切片组
经过研究发现，传统石蜡切片组病理组织块经过脱水、透明、浸蜡等环节后，外形会发生明显的收缩变化；假若上述操作的时间不合理，就非常容易出现组织过硬和切片易碎的现象；此组病理切片经HE染色后着色好，细胞质与细胞核有明显的红蓝对比，红细胞、纤维蛋白等物质着色良好；细胞没有变形、空泡化等异常现象；切片制作花费了大概36个小时。
2.2 快捷石蜡切片组
快捷石蜡切片组病理组织块经过脱水、透明、浸蜡等环节后，体积没有发生明显的变化，光镜下观察染色后的切片发现，细胞体积比传统石蜡组的要大；该方法处理的组织块硬度适中，切片时不容易产生碎片；切片HE染色着色好，细胞质与细胞核有着明显的红蓝对比，红细胞、纤维蛋白等物质着色良好；细胞无变形、空泡化等异常现象；整个的切片制作要花费约半小时的时间。
2.3 冰冻切片组
冰冻切片组病理切片质量受冷冻时间、温度、是否速冻等因素的影响较大；切片易干涸，染色时易脱落，不利于批量染色；切片HE染色镜下细胞核与细胞质对比较明显；切片较厚，欠清晰；整个切片制作大概要花费20-40分钟。
3、讨论
在此次试验中选用的脱水剂是低毒类试剂正丁醇，用此处理组织时能够有效减少组织收缩和硬化等问题的出现。而且，由于二甲苯易于挥发，毒性很大，对切片会产生不同程度的损害，所以正丁醇还可以替代二甲苯作为透明剂。在透明时选用硬脂酸和石蜡混合液置于恒温超声波仪中代替二甲苯，这样正丁醇和硬脂酸的配合使用会提高透明效果，缩短透明时间，且正丁醇能够溶解硬脂酸带入到组织之中的多余脂肪。
另外，脱水、透明、浸蜡选用具塞广口瓶，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底，有害气体的挥发造成人员健康伤害等现象。包埋后，石蜡的迅速冷却也很重要，选择冰箱4℃迅速冷却可以有效防止包埋块中产生结晶以造成切片时引起碎裂等现象的发生。
由于冰冻切片设备价格昂贵，很多实验室的能力不足以承担这些费用。而快捷石蜡切片制作法成本低，花费的时间段，也节省了很大的人力，所以此方法值得推广和应用。
结束语
综上所述，研究者要想制备一张清晰、有效的动物病理组织切片，就应该处理好每个细节，并善于发现问题、及时解决问题。而且先进的科学技术能够让切片的制作更加便捷、高效，如超声波在切片制作过程中的应用使整个制片时间由36h缩短到30min，所以说，动物病理切片的制作需要不断更新方法，从而为后续的实验研究奠定基础。
参考文献
[1] 李慧.病理组织石蜡切片制作体会及常见问题解析[J].临床与实验病理学杂志，2014，07：811-812.
[2] 孙岩.病理组织切片染色中的常見问题及解决方法[J].中国医药指南，2013，28：578-579.
[3] 党占翠，赵忠智，于守鸿，郑谊，张爱萍，王梅，魏绍振，赵小龙，杨永海.鼠疫实验动物病理切片制作方法的建立[J].河南预防医学杂志，2015，03：182-183.