【摘 要】
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目的 构建人凝血因子VII(FVII)与免疫球蛋白Fc片段融合基因(mFVII/Fc)的慢病毒表达载体,并检测其在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中的表达情况,获取mFVII/Fc稳定表达的干细胞载
【机 构】
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南昌大学研究生院医学部,南昌大学第一附属医院泌尿外科泌尿外科研究所
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目的 构建人凝血因子VII(FVII)与免疫球蛋白Fc片段融合基因(mFVII/Fc)的慢病毒表达载体,并检测其在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中的表达情况,获取mFVII/Fc稳定表达的干细胞载体.方法 体外克隆人凝血因子VII,用点突变技术在基因水平将341部位Lys突变为Ala后,利用DNA连接酶与免疫球蛋白IgG1 Fc片段的基因融合,经酶切整合,测序鉴定后转染人胚肾293T细胞包装为重组mFVII/Fc慢病毒载体,鉴定载体构建成功后,测定慢病毒滴度.确定转染第三代hBMSCs的最佳MOI值后批量转染,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,RT-PCR、ELISA分别在不同时间点对mFVII/Fc的mRNA及蛋白表达进行相对定量分析.结果 所构建融合基因与GenBank ID,AF272774对比,除同义变异外完全相符;包装的慢病毒滴度为2×108TU/ml;hBM-SCs鉴定结果为CD+29(98.08%)、CD+44(97.63%)、CD34(0.31%)、CD+45(0.58%);转染hBMSCs 72 h后的效率为(84±3)%,经RT-PCR及ELISA证实转染mFVII/Fc基因的hBMSCs有大量mRNA转录和蛋白表达水平.结论 实验成功获得了融合基因的hBMSCs稳定遗传表达载体,为靶向前列腺癌组织因子研究及肿瘤基因治疗研究提供了实验依据.
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