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摘要：采用传统培养的筛选方法，地球上99%以上的微生物还没能被人类开发生产活性物质，这使得自然界中微生物资源的开发利用受到极大限制。宏基因组文库技术的应用避开了微生物纯培养的问题，极大拓展了微生物资源的利用空间，目前被广泛应用于各种新的酶及活性物质的研究。在重点介绍宏基因组文库的构建及筛选方法等，以及宏基因组技术在微生物活性物质筛选中应用的基础上，对宏基因组研究存在的问题进行了探讨。
关键词：宏基因组文库；微生物；活性物质；筛选
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0005-03
收稿日期：2013-05-24
作者简介：高岳（1979—），男，江苏苏州人，博士，讲师，从事生物工程及微生物天然产物研究。Tel：（0512）66098727；E-mail：[email protected]。环境当中有超过99%的微生物不能进行人工培养，大多数微生物还没能被人类用来开发生产可能的有用产物[1-2]。用传统的微生物学方法没有办法对不可培养微生物的酶及其产物进行分析鉴定，但是，通过“宏基因组学”研究方法，可以直接从环境样品中提取微生物DNA，让微生物DNA在易培养宿主中克隆表达[3]。从自然界微生物群落中直接提取DNA后建立宏基因组文库，然后进行克隆筛选，目前被广泛应用于各种新的酶及活性物质的研究。
1宏基因组学的概念
1998年，Handelsman等首次提出了宏基因组（metagenome）的概念，是指特定环境中全部微生物基因的总和。宏基因组学（metagenomics）是一种新的微生物研究方法，它以环境样品中微生物群体基因组为研究对象，通过基因筛选和序列分析等手段，来研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系。宏基因组文库包含了可培养和不可培养微生物基因的总和，不需要使用传统的微生物纯培养技术，极大地拓宽了微生物资源的利用空间，为获得新的酶及生物活性物质提供了更广阔的平台。
2宏基因组文库的构建
2.1DNA提取
DNA提取方法主要有2種：一种是直接（原位）裂解法，直接裂解环境样品中的微生物细胞进行DNA抽提。这种方法操作简单、成本较低、DNA获得率比较高，也更具有代表性；但提出的DNA片段较小（1～50 kb），且用这种方法容易残留环境样品中的杂质，如腐殖酸、棕黄酸等，这些杂质对后续的PCR扩增等操作会产生强烈的影响。另一种是间接（异位）裂解法，即先采用差速离心等物理手段，将微生物细胞从环境样品中分离出来，再用较温和的方法来对DNA进行抽提。这种方法的优点是可以获得大片段DNA（20～500 kb），而且纯度高、杂质残留少；但这种方法操作繁琐，成本较高，DNA 获得率比较低，且用此法抽提到的DNA主要来自于和土壤颗粒附着力较弱的微生物个体。因此，要根据研究手段及目的基因的大小，选择合适的提取方法。Liles等证明了用甲酰胺高盐溶液处理的样品能够提取大片段DNA，并能有效地提高宏基因组文库的构建效率，这为获取完整的大片段DNA提供了可借鉴的方法[4]。
2.2文库构建
从环境样品中提取DNA，用于构建宏基因组文库，进而筛选各种活性物质。在构建文库时，应根据自身的研究目的和获得的DNA的量、纯度、片段大小等来选择载体和宿主。
载体的选择需要考虑载体的大小、载体拷贝数、插入片段的大小、所用宿主及筛选方法等因素[5]。常用的克隆载体包括质粒（plasmid，插入片段10 kb以下）、黏粒（cosmid，插入片段40 kb左右）和细菌人工染色体（BAC，插入片段可达 350 kb）等，可满足不同的插入片段大小要求。BAC 载体可以克隆大片段的DNA，增加了获得完整的指导大分子活性物质合成途径的编码基因或基因簇的机会，在宏基因组克隆表达中具有一定的优势。Gillespie等用细菌人工染色体载体pBeloBACⅡ构建了2个土壤样品的宏基因组BAC文库，获得了2 个具有广谱抗菌作用的新抗生素turbomycin A和 turbomycin B 及其合成酶基因簇[6]。
宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、外源基因的表达、目标性状筛选等因素[5]。研究结果表明，不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，因此，可根据不同研究目标选择不同的宿主菌株，如70%的抗生素来源于放线菌，若寻找抗菌、抗肿瘤活性物质，应选择链霉菌为宿主菌，而大肠杆菌则主要用于新型酶的筛选等[7]。大肠杆菌作为成熟的基因克隆表达受体细胞，仍然是研究宏基因组的首选宿主菌，如紫色杆菌素（violacein）C等在大肠杆菌中的成功表达[8]。链霉菌属编码次生代谢产物合成的基因以基因簇的形式存在，表达受到细胞信号交流和信号转导的调控，具备天然抗生素产生机制[9]。
3活性物质文库的筛选
采用传统方法进行生物活性物质筛选时，一般都是获得相应的混合物，然后还需要进行活性化合物分离、提纯和鉴定等一系列后续处理。高品质的活性物质分析需要培养或发酵，产生某种活性物质的细菌，在发酵时其合成能力可能会降低，甚至丧失。应用宏基因组技术进行筛选时，由于合成该物质的基因携带在一定载体上，其功能基本不会丢失。活性物质文库筛选是细菌之间通用某些功能基因及其表达调控子，克服了发酵限制，优越于传统筛选。基于环境宏基因组的高度复杂性，必须有高通量、高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的目标基因或活性分子。应用宏基因组技术筛选活性物质时，根据目的不同，可从以下不同水平设计不同的筛选方案。
3.1序列驱动筛选
序列驱动筛选是指根据已知的基因或基因表达产物的保守序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或PCR扩增，筛选具有目标序列的克隆子，以获得某一类结构或功能类似的蛋白质新分子或其编码基因[10-11]。来自海绵具有药用价值的天然产物大多数是复杂的聚酮类化合物，海绵宏基因组编码许多指导不同途径的聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）[12-13]。PKS包括1个或多个模块，每个模块都至少包括3个结构域：酮体合成酶（ketosynthase，KS）、酰基转移酶（acyl transferase，AT）、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP），其中，KS编码区同源性最高，因此，可以根据KS结构域的保守序列设计PCR引物[12-14]，从海绵宏基因组文库中筛选携带PKS基因的克隆。Courtoi等构建了1个可以在大肠杆菌和链霉菌间转移的穿梭Cosmid载体，并以此构建了1个土壤宏基因组文库，通过序列驱动筛选获得了新的抗肿瘤活性物质聚酮的合成酶基因簇[15]。序列筛选法的优点是不必依赖外源基因在宿主中的表达，但它无法筛选宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同的新基因，因此较难发现新的活性物质。不过，Gupta等认为，当宏基因组文库基因的保守序列与数据库中已知基因的保守序列相似度低于40%时，基于序列的筛选策略也可能筛选到新的功能产物[16]。 3.2功能驱动筛选
功能驱动筛选主要通过化学等手段，从宏基因组文库中检测表达目标活性物质的克隆子，这种方法具有较高灵敏度，产色素的阳性克隆在平板上呈现的颜色不同，可以被快速筛选出来，如Huang等从构建的中国南海深海沉积物Fosmid宏基因组文库中筛选到了产黑色素（melanin）的克隆[17]；或是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行筛选[18]。Hu等在1个南极荒漠土壤宏基因组文库中，使用含有底物甘油三酸酯三丁酸甘油酯的琼脂平板筛选到1种新的酯酶[19]。Neveu等从戈壁和死亡谷沙漠宏基因组文库中，在用脱脂牛奶作为底物的平板上分离到2个丝氨酸蛋白酶[20]。这种方法的优点是能找到各种新的酶及活性物质，但它受限于基因必须能在宿主中表达，表达产物能够正常溶解，并且產生的蛋白质要能够正确地折叠。然而，很多克隆的外源基因并不能在新的遗传背景中实现表达。
3.3功能筛选法的改进
宏基因组文库在进行功能筛选时，存在诸多问题，需要对宿主及载体系统进行改造及完善，改进表达系统，从而解决宏基因组基因在多宿主系统中的表达问题，如：可采用穿梭载体，使其在不同宿主中进行目的基因的表达，或是对大肠杆菌进行改造，扩大它对基因的表达范围。目前，宏基因组文库的构建常采用的表达系统是大肠杆菌和链霉菌，可以通过综合考虑宿主的天然生物合成能力和它对外源启动子的倾向性，拓展新的宿主菌用于宏基因组的研究。Craig等以R. metallidurans为克隆宿主，成功获得了土壤eDNA 的编码产物，其中有2个是新天然产物，他们还进一步验证了获得的产物在大肠杆菌中不能表达或无法被检测到表达，进而证明了Ralstonia metallidurans可以作为宏基因组学文库新的模式系统，用于发现新产物[21]。另外，还可结合其他相关技术来改进功能筛选法，如在克隆前运用超速离心法、密度梯度离心法、稳定同位素示踪技术等[22-23]，对样品中感兴趣的基因或基因组进行富集，从而提高阳性克隆的比例。将亲和筛选技术和噬菌体表面展示表达产物结合起来分离DNA，是一个高效易控制的高通量筛选方法，在宏基因组文库中即使是稀少的DNA序列也可得到富集，有利于文库中稀有DNA序列的表达[24]。
4部分微生物活性物质筛选情况
利用宏基因组技术筛选活性物质被证实是一种行之有效的方法，其效率远远超过其他方法并且具有广阔的前景，是基因工程研究的一个主要方向。目前，研究人员已经利用功能和序列为基础的方法通过宏基因组筛选，鉴定了比较多的新型酶及抗菌活性物质（表1），潜在的工业开发利用价值很大。
表1宏基因组文库筛选的活性物质
活性物质1文献β-半乳糖苷酶1Wang等[25] ，2010鞣酸酶1Yao等[26]，2011α-淀粉酶1Liu等[27]，2012内切葡聚糖酶1Pang等[28]，2009内酯酶1Schipper等[29] ，2009DNA聚合酶1Simon等[30]，2009ATP酶1de la Iglesia等[31]，2010糖肽基因1Banik 等[32]，2008核糖体环肽1Sivonen等[33]，2010抗癌物patellamide基因1Long等[34]，2005Ⅱ型聚酮合成酶基因1King等[35]，2009抗癌物ET-743基因1Rath等[36]，2011阿普拉毒素 1Grindberg等[37]，2011异氰化物1Brady等[38]，2005靛红、靛蓝1Lim等[39]，2005低温脂肪酶1Jeon等[40]，2009耐盐纤维素酶1Voget等[41]，2006多酚氧化酶1Beloqui等[42]，2006羧酸酯酶1Rashamuse等[43]，2009双加氧酶1Suenaga等[44]，2007
5展望
运用宏基因组学技术，有可能挖掘和利用99%以上的不可培养微生物，这些微生物蕴藏着巨大的基因多样性，提供了丰富的研究资源。虽然采用宏基因组技术获得的活性物质目前并不是很多，但它改变了我们解决很多问题的思路，丰富和拓展了对微生物世界多样性的认识，加速了新基因的发现。随着未来研究手段的不断进步，细菌遗传学、分子生物学、基因组学、生物信息学、合成生物学和天然产物化学等学科和领域的发展，必将使我们能从各类环境基因组文库中获得更多具有高价值的新酶、抗生素和其他活性产物，宏基因组学技术也必将发挥越来越大的作用，造福人类。
参考文献：
[1]Torsvik V，Goksoyr J，Daae F L. High diversity in DNA of soil bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology，1990，56（3）：782-787.
[2]Rappe M S，Giovannoni S J. The uncultured microbial majority[J]. Annual Review of Microbiology，2003，57：369-394.
[3]Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products[J]. Chemistry
关键词：宏基因组文库；微生物；活性物质；筛选
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0005-03
收稿日期：2013-05-24
作者简介：高岳（1979—），男，江苏苏州人，博士，讲师，从事生物工程及微生物天然产物研究。Tel：（0512）66098727；E-mail：[email protected]。环境当中有超过99%的微生物不能进行人工培养，大多数微生物还没能被人类用来开发生产可能的有用产物[1-2]。用传统的微生物学方法没有办法对不可培养微生物的酶及其产物进行分析鉴定，但是，通过“宏基因组学”研究方法，可以直接从环境样品中提取微生物DNA，让微生物DNA在易培养宿主中克隆表达[3]。从自然界微生物群落中直接提取DNA后建立宏基因组文库，然后进行克隆筛选，目前被广泛应用于各种新的酶及活性物质的研究。
1宏基因组学的概念
1998年，Handelsman等首次提出了宏基因组（metagenome）的概念，是指特定环境中全部微生物基因的总和。宏基因组学（metagenomics）是一种新的微生物研究方法，它以环境样品中微生物群体基因组为研究对象，通过基因筛选和序列分析等手段，来研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系。宏基因组文库包含了可培养和不可培养微生物基因的总和，不需要使用传统的微生物纯培养技术，极大地拓宽了微生物资源的利用空间，为获得新的酶及生物活性物质提供了更广阔的平台。
2宏基因组文库的构建
2.1DNA提取
DNA提取方法主要有2種：一种是直接（原位）裂解法，直接裂解环境样品中的微生物细胞进行DNA抽提。这种方法操作简单、成本较低、DNA获得率比较高，也更具有代表性；但提出的DNA片段较小（1～50 kb），且用这种方法容易残留环境样品中的杂质，如腐殖酸、棕黄酸等，这些杂质对后续的PCR扩增等操作会产生强烈的影响。另一种是间接（异位）裂解法，即先采用差速离心等物理手段，将微生物细胞从环境样品中分离出来，再用较温和的方法来对DNA进行抽提。这种方法的优点是可以获得大片段DNA（20～500 kb），而且纯度高、杂质残留少；但这种方法操作繁琐，成本较高，DNA 获得率比较低，且用此法抽提到的DNA主要来自于和土壤颗粒附着力较弱的微生物个体。因此，要根据研究手段及目的基因的大小，选择合适的提取方法。Liles等证明了用甲酰胺高盐溶液处理的样品能够提取大片段DNA，并能有效地提高宏基因组文库的构建效率，这为获取完整的大片段DNA提供了可借鉴的方法[4]。
2.2文库构建
从环境样品中提取DNA，用于构建宏基因组文库，进而筛选各种活性物质。在构建文库时，应根据自身的研究目的和获得的DNA的量、纯度、片段大小等来选择载体和宿主。
载体的选择需要考虑载体的大小、载体拷贝数、插入片段的大小、所用宿主及筛选方法等因素[5]。常用的克隆载体包括质粒（plasmid，插入片段10 kb以下）、黏粒（cosmid，插入片段40 kb左右）和细菌人工染色体（BAC，插入片段可达 350 kb）等，可满足不同的插入片段大小要求。BAC 载体可以克隆大片段的DNA，增加了获得完整的指导大分子活性物质合成途径的编码基因或基因簇的机会，在宏基因组克隆表达中具有一定的优势。Gillespie等用细菌人工染色体载体pBeloBACⅡ构建了2个土壤样品的宏基因组BAC文库，获得了2 个具有广谱抗菌作用的新抗生素turbomycin A和 turbomycin B 及其合成酶基因簇[6]。
宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、外源基因的表达、目标性状筛选等因素[5]。研究结果表明，不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，因此，可根据不同研究目标选择不同的宿主菌株，如70%的抗生素来源于放线菌，若寻找抗菌、抗肿瘤活性物质，应选择链霉菌为宿主菌，而大肠杆菌则主要用于新型酶的筛选等[7]。大肠杆菌作为成熟的基因克隆表达受体细胞，仍然是研究宏基因组的首选宿主菌，如紫色杆菌素（violacein）C等在大肠杆菌中的成功表达[8]。链霉菌属编码次生代谢产物合成的基因以基因簇的形式存在，表达受到细胞信号交流和信号转导的调控，具备天然抗生素产生机制[9]。
3活性物质文库的筛选
采用传统方法进行生物活性物质筛选时，一般都是获得相应的混合物，然后还需要进行活性化合物分离、提纯和鉴定等一系列后续处理。高品质的活性物质分析需要培养或发酵，产生某种活性物质的细菌，在发酵时其合成能力可能会降低，甚至丧失。应用宏基因组技术进行筛选时，由于合成该物质的基因携带在一定载体上，其功能基本不会丢失。活性物质文库筛选是细菌之间通用某些功能基因及其表达调控子，克服了发酵限制，优越于传统筛选。基于环境宏基因组的高度复杂性，必须有高通量、高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的目标基因或活性分子。应用宏基因组技术筛选活性物质时，根据目的不同，可从以下不同水平设计不同的筛选方案。
3.1序列驱动筛选
序列驱动筛选是指根据已知的基因或基因表达产物的保守序列设计探针或PCR引物，通过核酸杂交或PCR扩增，筛选具有目标序列的克隆子，以获得某一类结构或功能类似的蛋白质新分子或其编码基因[10-11]。来自海绵具有药用价值的天然产物大多数是复杂的聚酮类化合物，海绵宏基因组编码许多指导不同途径的聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）[12-13]。PKS包括1个或多个模块，每个模块都至少包括3个结构域：酮体合成酶（ketosynthase，KS）、酰基转移酶（acyl transferase，AT）、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP），其中，KS编码区同源性最高，因此，可以根据KS结构域的保守序列设计PCR引物[12-14]，从海绵宏基因组文库中筛选携带PKS基因的克隆。Courtoi等构建了1个可以在大肠杆菌和链霉菌间转移的穿梭Cosmid载体，并以此构建了1个土壤宏基因组文库，通过序列驱动筛选获得了新的抗肿瘤活性物质聚酮的合成酶基因簇[15]。序列筛选法的优点是不必依赖外源基因在宿主中的表达，但它无法筛选宏基因组文库中那些和现有基因序列完全不同的新基因，因此较难发现新的活性物质。不过，Gupta等认为，当宏基因组文库基因的保守序列与数据库中已知基因的保守序列相似度低于40%时，基于序列的筛选策略也可能筛选到新的功能产物[16]。 3.2功能驱动筛选
功能驱动筛选主要通过化学等手段，从宏基因组文库中检测表达目标活性物质的克隆子，这种方法具有较高灵敏度，产色素的阳性克隆在平板上呈现的颜色不同，可以被快速筛选出来，如Huang等从构建的中国南海深海沉积物Fosmid宏基因组文库中筛选到了产黑色素（melanin）的克隆[17]；或是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行筛选[18]。Hu等在1个南极荒漠土壤宏基因组文库中，使用含有底物甘油三酸酯三丁酸甘油酯的琼脂平板筛选到1种新的酯酶[19]。Neveu等从戈壁和死亡谷沙漠宏基因组文库中，在用脱脂牛奶作为底物的平板上分离到2个丝氨酸蛋白酶[20]。这种方法的优点是能找到各种新的酶及活性物质，但它受限于基因必须能在宿主中表达，表达产物能够正常溶解，并且產生的蛋白质要能够正确地折叠。然而，很多克隆的外源基因并不能在新的遗传背景中实现表达。
3.3功能筛选法的改进
宏基因组文库在进行功能筛选时，存在诸多问题，需要对宿主及载体系统进行改造及完善，改进表达系统，从而解决宏基因组基因在多宿主系统中的表达问题，如：可采用穿梭载体，使其在不同宿主中进行目的基因的表达，或是对大肠杆菌进行改造，扩大它对基因的表达范围。目前，宏基因组文库的构建常采用的表达系统是大肠杆菌和链霉菌，可以通过综合考虑宿主的天然生物合成能力和它对外源启动子的倾向性，拓展新的宿主菌用于宏基因组的研究。Craig等以R. metallidurans为克隆宿主，成功获得了土壤eDNA 的编码产物，其中有2个是新天然产物，他们还进一步验证了获得的产物在大肠杆菌中不能表达或无法被检测到表达，进而证明了Ralstonia metallidurans可以作为宏基因组学文库新的模式系统，用于发现新产物[21]。另外，还可结合其他相关技术来改进功能筛选法，如在克隆前运用超速离心法、密度梯度离心法、稳定同位素示踪技术等[22-23]，对样品中感兴趣的基因或基因组进行富集，从而提高阳性克隆的比例。将亲和筛选技术和噬菌体表面展示表达产物结合起来分离DNA，是一个高效易控制的高通量筛选方法，在宏基因组文库中即使是稀少的DNA序列也可得到富集，有利于文库中稀有DNA序列的表达[24]。
4部分微生物活性物质筛选情况
利用宏基因组技术筛选活性物质被证实是一种行之有效的方法，其效率远远超过其他方法并且具有广阔的前景，是基因工程研究的一个主要方向。目前，研究人员已经利用功能和序列为基础的方法通过宏基因组筛选，鉴定了比较多的新型酶及抗菌活性物质（表1），潜在的工业开发利用价值很大。
表1宏基因组文库筛选的活性物质
活性物质1文献β-半乳糖苷酶1Wang等[25] ，2010鞣酸酶1Yao等[26]，2011α-淀粉酶1Liu等[27]，2012内切葡聚糖酶1Pang等[28]，2009内酯酶1Schipper等[29] ，2009DNA聚合酶1Simon等[30]，2009ATP酶1de la Iglesia等[31]，2010糖肽基因1Banik 等[32]，2008核糖体环肽1Sivonen等[33]，2010抗癌物patellamide基因1Long等[34]，2005Ⅱ型聚酮合成酶基因1King等[35]，2009抗癌物ET-743基因1Rath等[36]，2011阿普拉毒素 1Grindberg等[37]，2011异氰化物1Brady等[38]，2005靛红、靛蓝1Lim等[39]，2005低温脂肪酶1Jeon等[40]，2009耐盐纤维素酶1Voget等[41]，2006多酚氧化酶1Beloqui等[42]，2006羧酸酯酶1Rashamuse等[43]，2009双加氧酶1Suenaga等[44]，2007
5展望
运用宏基因组学技术，有可能挖掘和利用99%以上的不可培养微生物，这些微生物蕴藏着巨大的基因多样性，提供了丰富的研究资源。虽然采用宏基因组技术获得的活性物质目前并不是很多，但它改变了我们解决很多问题的思路，丰富和拓展了对微生物世界多样性的认识，加速了新基因的发现。随着未来研究手段的不断进步，细菌遗传学、分子生物学、基因组学、生物信息学、合成生物学和天然产物化学等学科和领域的发展，必将使我们能从各类环境基因组文库中获得更多具有高价值的新酶、抗生素和其他活性产物，宏基因组学技术也必将发挥越来越大的作用，造福人类。
参考文献：
[1]Torsvik V，Goksoyr J，Daae F L. High diversity in DNA of soil bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology，1990，56（3）：782-787.
[2]Rappe M S，Giovannoni S J. The uncultured microbial majority[J]. Annual Review of Microbiology，2003，57：369-394.
[3]Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products[J]. Chemistry