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（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040）
摘要
［目的］研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化。［方法］通过设计、构建Jztx-III/pPIC9k表达载体，经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达，并利用C-端6×His标签进行分离纯化。［结果］Jztx-III可以在毕赤酵母GS115中高效表达，经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L。［结论］该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题。
关键词 蜘蛛毒素；毕赤酵母；基因工程
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06166-01
The Expression and Purification of Jingzhao Toxin in Pichia pastoris
JIANG Qianqian, CHENG Yupeng et al
(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)
Abstract ［Objective］ To study expression and purification of Jingzhao toxin in Pichia pastoris. ［Method］ JztxIII GS115/pPIC9k plasmid was constructed to express Jingzhao toxinIII in Pichia pastoris. A 6×His tag in Cterminus was employed to purify the recombinant Jztx III. ［Result］ The results showed that Jztx III can be expressed in Pichia pastoris GS115 effectively. The production of Jztx III can reach to 95 mg/L after purified by affinity chromatography. ［Conclusion］ The experiment results solve the problem of lower yield of Jingzhao toxin limited resource.
Key wordsSpider toxin; Pichia pastoris; Genetic engineering
基金项目 黑龙江中医药大学校基金（201004）；黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划（2012RCQ12）。
作者简介
蒋倩倩（1981-），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，硕士，从事生物制药研究。*通讯作者，副教授，博士，从事生物制药研究。
收稿日期 20140604
蜘蛛毒素成分复杂，由一系列蛋白质、多肽、神经毒素、核酸、氨基酸、无机盐组成，这些成分可以对脊椎动物和无脊椎动物产生不同的生物学效应［1］。根据蜘蛛毒素的药理和生物化学特性，蜘蛛毒素可以分为离子通道毒素、非神经毒素、酶及低分子量化合物［2］。
敬钊毒素-III (Jztx-III，分子量3 919.3 Da)是从中国狼蛛敬钊缨毛蛛中分离的小分子多肽，由36个氨基酸组成且分子结构复杂，其内部含有3个交错的二硫键分别是：I-IV, II-V和 III-VI (Cys4-Cys19, Cys11-Cys24, and Cys18-Cys31)［3］。这种毒素专一作用于钾离子电压门控通道Kv2.1和钠离子电压门控通道Nav1.5，而对其他亚型的电压通道无作用。正是由于其对电压离子通道的特异性及独特的分子机制，使得Jztx-III成为研究电压敏感型毒素和离子通道相互作用的理想工具。但是由于敬钊毒素来源有限且含量低，限制了其在研究和医疗上的应用，因此研究开发蜘蛛毒素合成方法降低生产成本是目前亟待解决的问题。基因工程是生产生物活性肽的理想途径，但目前对于重组Jztx-III多肽的表达的研究鲜有报道。笔者通过设计构建pPIC9k/Jztx-III表达载体，在毕赤酵母中表达重组敬钊毒素-III并利用其C-端6×His标签进行分离纯化，以期为蜘蛛毒素的药物开发奠定基础。
1材料与方法
1.1 材料
表达载体 pPIC9k、E. coli JM109、毕赤酵母GS115菌株，均由黑龙江中医药大学生物技术教研室保存。
1.2 Jztx-III的基因设计与合成
根据敬钊毒素-III全长基因序列及毕赤酵母偏爱密码子对其进行全基因合成，5’端添加EcoRⅠ位点，3’端添加NotⅠ位点，同时在3’端添加编码6×His的分离纯化标签，该基因合成由上海生工完成。
1.3 重组表达质粒的构建
用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切pPIC9k载体，以T4连接酶将合成的JZTX-III基因与载体连接，16 ℃连接12 h，连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞JM109中。挑出单菌落，进行双酶切鉴定，并送往上海生工进行测序。
1.4 pPIC9k/Jztx-III电转化毕赤酵母
用SacⅠ酶切重组表达质粒 pPIC9k/JZTX-III使之线性化，电击转化至毕赤酵母菌GS115，转化菌液涂布 RDB平板，30 ℃培养 72 h，挑取单克隆，在MD平板上筛选His+表型，分别接种于G418的YPD培养基平板上，筛选多拷贝转化子，对阳性重组子进行PCR鉴定。
1.5 Jztx-III的诱导表达
挑选阳性菌落，置于BMGY培养基中，每24 h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5%~1.0%。用15% Trincine-SDS-PAGE 检测JZTX-III表达情况。
1.6 Jztx-III的分离纯化
菌体发酵离心所获得上清，经Millipore 超滤管浓缩除盐，利用High Affinity Ni-NTA Resin（南京金斯瑞）进行亲和层析。洗脱产物由15% Trincine-SDS-PAGE检测。
2 结果与分析
2.1 pPIC9k/Jztx-III表达载体构建
根据敬钊毒素-III全长基因序列并依据毕赤酵母偏爱密码子设计合成敬钊毒素-III的全长DNA序列，与表达载体pPIC9k连接后，经EcoR I和Not I双酶切及测序结果表明片段大小及序列与pPIC9k及Jztx-III大小相符。
2.2 pPIC9k/Jztx-III阳性转化子的鉴定
pPIC9k/Jztx-III经SacⅠ酶线性化后，电转化至毕赤酵母菌GS115，并经MD
平板、G418平板筛选获得了多拷贝转化子。选取其中8株His+阳性重组子进行PCR鉴定（图1）。经过PCR扩增后获得2个片段，分别为2.2 kb的AOX基因和642 bp（Jztx-III+492kb侧翼序列）片段，证明Jztx-III已经整合入GS115基因组。
图1pPIC9k/Jztx-III阳性转化子的PCR鉴定结果
2.3 重组Jztx-III的分离纯化
含有pPIC9k/Jztx-III的阳性菌落在BMGY培养基培养并甲醇诱导72 h后产量达到最高，利用High Affinity Ni-NTA Resin进行亲和层析，样品经洗脱液洗脱后，15% Tricine-SDS-PAGE检测（图2），结果显示，经纯化后获得分子量为5 kD左右的多肽，该分子量与敬钊毒素-3理论值3.9 kD加0.84 kD的6×His标签相符。经BCA法检测发现，Jztx-III浓度可达到95 mg/L。
图2 Tricine-SDS-PAGE 检测纯化的Jztx-III
3 结论与讨论
蜘蛛毒素为富含二硫键的多肽，其分子量小、结构复杂、体外的折叠效率比较低，因此很难通过化学合成的方法复现其功能区。采用基因工程方法，在体内进行蜘蛛毒素的合成是一条理想的途径。试验选择巴斯德毕赤酵母作为Jztx-III
的表达体系，其优势在于酵母表达系统是具有高效分泌的真核表达系统，可对目的蛋白进行翻译后修饰，帮助敬钊毒素形成正确结构。同时，为了进一步提高Jztx-III的表达量，试验根据毕赤酵母偏爱密码子对Jztx-III基因进行了优化设计，并在其C-端添加了6×His标签，构建了pPIC9k/Jztx-III表达载体，该标签的加入有利于表达后的分离纯化且不对多肽的活性有影响。经电转化、甲醇诱导、High Affinity Ni-NTA纯化后，Jztx-III可以成功在毕赤酵母GS115中表达，产量达到95 mg/L，实现了Jztx-III在毕赤酵母中得高效表达。而对于重组Jztx-III的生物学活性，有待于进一步研究。
参考文献
［1］ ORI M，IKEDA H.Spider venoms and spider toxins［J］.Journal of Toxicology-Toxin Reviews，1998，17(3):405-426.
［2］ RASH L D，HODGSON W C.Pharmacology and biochemistry of spider venoms［J］.Toxicon，2001，40(3):225-254.
［3］ XIAO Y C，TANG J Z，YANG Y J，et al.JingzhaotoxinIII，a novel spider toxin inhibiting activation of voltagegated sodium channel in rat cardiac myocytes［J］.J Biol Chem，2004，279(25):26220-26226.
摘要
［目的］研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化。［方法］通过设计、构建Jztx-III/pPIC9k表达载体，经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达，并利用C-端6×His标签进行分离纯化。［结果］Jztx-III可以在毕赤酵母GS115中高效表达，经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L。［结论］该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题。
关键词 蜘蛛毒素；毕赤酵母；基因工程
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06166-01
The Expression and Purification of Jingzhao Toxin in Pichia pastoris
JIANG Qianqian, CHENG Yupeng et al
(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)
Abstract ［Objective］ To study expression and purification of Jingzhao toxin in Pichia pastoris. ［Method］ JztxIII GS115/pPIC9k plasmid was constructed to express Jingzhao toxinIII in Pichia pastoris. A 6×His tag in Cterminus was employed to purify the recombinant Jztx III. ［Result］ The results showed that Jztx III can be expressed in Pichia pastoris GS115 effectively. The production of Jztx III can reach to 95 mg/L after purified by affinity chromatography. ［Conclusion］ The experiment results solve the problem of lower yield of Jingzhao toxin limited resource.
Key wordsSpider toxin; Pichia pastoris; Genetic engineering
基金项目 黑龙江中医药大学校基金（201004）；黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划（2012RCQ12）。
作者简介
蒋倩倩（1981-），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，硕士，从事生物制药研究。*通讯作者，副教授，博士，从事生物制药研究。
收稿日期 20140604
蜘蛛毒素成分复杂，由一系列蛋白质、多肽、神经毒素、核酸、氨基酸、无机盐组成，这些成分可以对脊椎动物和无脊椎动物产生不同的生物学效应［1］。根据蜘蛛毒素的药理和生物化学特性，蜘蛛毒素可以分为离子通道毒素、非神经毒素、酶及低分子量化合物［2］。
敬钊毒素-III (Jztx-III，分子量3 919.3 Da)是从中国狼蛛敬钊缨毛蛛中分离的小分子多肽，由36个氨基酸组成且分子结构复杂，其内部含有3个交错的二硫键分别是：I-IV, II-V和 III-VI (Cys4-Cys19, Cys11-Cys24, and Cys18-Cys31)［3］。这种毒素专一作用于钾离子电压门控通道Kv2.1和钠离子电压门控通道Nav1.5，而对其他亚型的电压通道无作用。正是由于其对电压离子通道的特异性及独特的分子机制，使得Jztx-III成为研究电压敏感型毒素和离子通道相互作用的理想工具。但是由于敬钊毒素来源有限且含量低，限制了其在研究和医疗上的应用，因此研究开发蜘蛛毒素合成方法降低生产成本是目前亟待解决的问题。基因工程是生产生物活性肽的理想途径，但目前对于重组Jztx-III多肽的表达的研究鲜有报道。笔者通过设计构建pPIC9k/Jztx-III表达载体，在毕赤酵母中表达重组敬钊毒素-III并利用其C-端6×His标签进行分离纯化，以期为蜘蛛毒素的药物开发奠定基础。
1材料与方法
1.1 材料
表达载体 pPIC9k、E. coli JM109、毕赤酵母GS115菌株，均由黑龙江中医药大学生物技术教研室保存。
1.2 Jztx-III的基因设计与合成
根据敬钊毒素-III全长基因序列及毕赤酵母偏爱密码子对其进行全基因合成，5’端添加EcoRⅠ位点，3’端添加NotⅠ位点，同时在3’端添加编码6×His的分离纯化标签，该基因合成由上海生工完成。
1.3 重组表达质粒的构建
用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切pPIC9k载体，以T4连接酶将合成的JZTX-III基因与载体连接，16 ℃连接12 h，连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞JM109中。挑出单菌落，进行双酶切鉴定，并送往上海生工进行测序。
1.4 pPIC9k/Jztx-III电转化毕赤酵母
用SacⅠ酶切重组表达质粒 pPIC9k/JZTX-III使之线性化，电击转化至毕赤酵母菌GS115，转化菌液涂布 RDB平板，30 ℃培养 72 h，挑取单克隆，在MD平板上筛选His+表型，分别接种于G418的YPD培养基平板上，筛选多拷贝转化子，对阳性重组子进行PCR鉴定。
1.5 Jztx-III的诱导表达
挑选阳性菌落，置于BMGY培养基中，每24 h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5%~1.0%。用15% Trincine-SDS-PAGE 检测JZTX-III表达情况。
1.6 Jztx-III的分离纯化
菌体发酵离心所获得上清，经Millipore 超滤管浓缩除盐，利用High Affinity Ni-NTA Resin（南京金斯瑞）进行亲和层析。洗脱产物由15% Trincine-SDS-PAGE检测。
2 结果与分析
2.1 pPIC9k/Jztx-III表达载体构建
根据敬钊毒素-III全长基因序列并依据毕赤酵母偏爱密码子设计合成敬钊毒素-III的全长DNA序列，与表达载体pPIC9k连接后，经EcoR I和Not I双酶切及测序结果表明片段大小及序列与pPIC9k及Jztx-III大小相符。
2.2 pPIC9k/Jztx-III阳性转化子的鉴定
pPIC9k/Jztx-III经SacⅠ酶线性化后，电转化至毕赤酵母菌GS115，并经MD
平板、G418平板筛选获得了多拷贝转化子。选取其中8株His+阳性重组子进行PCR鉴定（图1）。经过PCR扩增后获得2个片段，分别为2.2 kb的AOX基因和642 bp（Jztx-III+492kb侧翼序列）片段，证明Jztx-III已经整合入GS115基因组。
图1pPIC9k/Jztx-III阳性转化子的PCR鉴定结果
2.3 重组Jztx-III的分离纯化
含有pPIC9k/Jztx-III的阳性菌落在BMGY培养基培养并甲醇诱导72 h后产量达到最高，利用High Affinity Ni-NTA Resin进行亲和层析，样品经洗脱液洗脱后，15% Tricine-SDS-PAGE检测（图2），结果显示，经纯化后获得分子量为5 kD左右的多肽，该分子量与敬钊毒素-3理论值3.9 kD加0.84 kD的6×His标签相符。经BCA法检测发现，Jztx-III浓度可达到95 mg/L。
图2 Tricine-SDS-PAGE 检测纯化的Jztx-III
3 结论与讨论
蜘蛛毒素为富含二硫键的多肽，其分子量小、结构复杂、体外的折叠效率比较低，因此很难通过化学合成的方法复现其功能区。采用基因工程方法，在体内进行蜘蛛毒素的合成是一条理想的途径。试验选择巴斯德毕赤酵母作为Jztx-III
的表达体系，其优势在于酵母表达系统是具有高效分泌的真核表达系统，可对目的蛋白进行翻译后修饰，帮助敬钊毒素形成正确结构。同时，为了进一步提高Jztx-III的表达量，试验根据毕赤酵母偏爱密码子对Jztx-III基因进行了优化设计，并在其C-端添加了6×His标签，构建了pPIC9k/Jztx-III表达载体，该标签的加入有利于表达后的分离纯化且不对多肽的活性有影响。经电转化、甲醇诱导、High Affinity Ni-NTA纯化后，Jztx-III可以成功在毕赤酵母GS115中表达，产量达到95 mg/L，实现了Jztx-III在毕赤酵母中得高效表达。而对于重组Jztx-III的生物学活性，有待于进一步研究。
参考文献
［1］ ORI M，IKEDA H.Spider venoms and spider toxins［J］.Journal of Toxicology-Toxin Reviews，1998，17(3):405-426.
［2］ RASH L D，HODGSON W C.Pharmacology and biochemistry of spider venoms［J］.Toxicon，2001，40(3):225-254.
［3］ XIAO Y C，TANG J Z，YANG Y J，et al.JingzhaotoxinIII，a novel spider toxin inhibiting activation of voltagegated sodium channel in rat cardiac myocytes［J］.J Biol Chem，2004，279(25):26220-26226.