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摘 要 弱毒株是利用交叉保護防治植物病毒病害的关键限制因子。通过对马铃薯Y病毒属病毒（强、弱毒株）的全长及部分氨基酸序列比对分析，筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）。采用定点突变和Gibson拼接法，分别成功构建了4种含有2个突变位点（L754和N787）、4个突变位点（I309、K481、F753和D944）、6个突变位点（I309、K481、F753、L754、N787和D944）和8个突变位点（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）的PRSV-LM全长cDNA侵染性克隆突变体：pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8。经人工接种、病症观察和RT-PCR检测，4种突变体克隆均能系统性侵染非转基因番木瓜植株，除克隆pGprsvm2的病症表现与亲本强毒株PRSV-LM一致外，其他多位点突变的克隆pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上的病症严重程度出现依次减弱，而克隆pGprsvm8的病症最弱，且延迟2周发病。本实验初步验证了6个氨基酸突变位点（I309→S、K481→Q、K598→E、F753→L、R728→I和D944→N）与PRSV-LM的病症表现及致病力相关，其中K598→E和R728→I可能是影响致病性的关键位点。
关键词 番木瓜环斑病毒；弱毒株；定点突变；交叉保护
中图分类号 Q949.759.6 文献标识码 A
番木瓜（Carica papaya L.）又称木瓜、乳瓜、万寿果，是热带、亚热带重要的经济果蔬之一。番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒，是威胁番木瓜种植产业发展最为严重的病害[1]。目前，番木瓜环斑病还没有根治的办法，仅采取选育抗病新品种，且结合栽培技术为主的综合防治措施。主要从选种耐病品种、改进栽培管理措施、消灭传毒介体、化学防治、及时砍除病株、利用弱毒系防治病毒病害及空间避病这些手段进行防预[2]。然而，选育耐病或抗病品种的方法并不理想，栽培管理方面又需耗费巨大的人力、财力和时间。因此，急需寻求一种环境友好、高效便捷、应用前景广的防控PRSV的新方法。
交叉保护（mild strains cross protection， MSCP）是防治植物病毒病为害的一种重要的有效方法，是指一种病毒侵染植株后防止相同病毒的不同株系或亲缘关系相近的另外一种病毒的侵染[3]。McKinney[4]于1929年首次发现烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）在烟草上存在交叉保护现象。随后，交叉保护作用在植物病毒上有研究报道，如辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）[5]、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）[6]、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）[7]、日本山药花叶病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）[8]、苹果花叶病毒（Apple mosaic virus，ApMV）[9]、李痘病毒（Plum pox virus， PPV）[10]、 花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus， CaMV）[11]、 菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus， BYMV）[12]、可可肿枝病毒（Cocoa swollen shoot virus， CSSV）[13]、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）[14]、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）[15]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）[16]、 TMV[17]和PRSV[18]等， 目前，已大规模商业化应用于生产实践的有TMV[19]、 CTV[20-21]、 PRSV[22-23]和ZYMV[15]。
早在20世纪80年代，利用亚硝酸诱变美国夏威夷的番木瓜环斑病毒强毒株HA获得其弱毒株HA5-1并进行交叉保护防控PRSV研究，在中国台湾和美国佛罗里达、夏威夷等地区得到很好的推广应用[22， 24]。但弱株系的保护作用存在株系专化性问题[25-26]，如HA5-1弱株系对夏威夷野生株系的保护作用比对中国台湾株系的强[27]，对中国华南地区PRSV株系的保护作用很差[25]，对泰国株系和墨西哥株系没有保护作用[26]。进一步的研究结果表明，PRSV株系间的交互保护作用程度与株系间的亲缘关系呈正相关[25， 28]。因此，从当地的PRSV株系中选择一个优势株系进行诱变筛选弱株系是一种最佳做法。本研究利用反向遗传学技术对马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株的氨基酸序列进行比对分析，旨在筛选出决定致病性的关键位点，采用定点突变海南PRSV强毒株LM的方法，快速构建、筛选病症显著减弱的弱毒株，用于后续交叉保护效果研究，以期防控危害海南地区番木瓜种植产业最为严重的PRSV病毒病。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 PRSV强毒株LM（登录号：KT633943）由本实验室从混合感染的番木瓜样品中分离、保存，并构建其全长cDNA侵染性克隆pPRSV-LM[29]。非转基因番木瓜（Solo）由本实验室保存。
1.1.2 菌株及载体 大肠杆菌感受态Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司；本实验使用的农杆菌C58C1（携带pSoup辅助质粒）由法国Thierry Candresse[30]实验室惠赠；构建侵染性克隆的载体pGreenII-35S（登录号：KX826944）由本实验室构建并保存。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。 1.1.3 主要試剂 高保真酶Prime STAR HS（Premix）、 Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）、 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、 PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit均购自TaKaRa公司； Trizol购自Thermo Fisher Scientific公司； Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列多重比对分析 本研究共选用33个马铃薯Y病毒属病毒（强、弱毒株）的全长或部分氨基酸序列进行比对分析（图1），包括15个PRSV的分离物和18个其他马铃薯Y病毒属病毒分离物，其中3个弱毒株：夏威夷PRSV强毒株HA经化学诱变获得的弱毒株HA 5-1，法国从自然界筛选获得的ZYMV弱毒株WK和日本的BYMV弱毒株M11。使用Vector NTI advance 11软件进行氨基酸序列多重比对分析。
1.2.2 引物设计合成及测序 根据PRSV-LM全长基因组序列、pGreenII-35S载体序列及8个突变位点，利用Verctor NTI advance 11软件，设计Gibson拼接法构建4种PRSV-LM弱毒突变体的引物（表1），引物合成和测序均由上海立菲生物技术有限公司完成。
1.2.3 亚克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的构建 用引物对prsv5F和prsv1011I/S-R、prsv1011I/S-F和prsv1526K/Q-R、prsv1526K/Q-F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv2915D/N-R、prsv2915D/N-F和prsv3400R从质粒pPRSV-LM上分别扩增含突变位点（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的6个小片段1、2、3、4、5、6。将片段1、2、3和片段4、5、6分别进行套叠PCR扩增，结果获得片段123和片段456，经加A处理后分别连接至pMD18-T载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌感受态Trans5α，经菌液PCR和测序鉴定分析，获得亚克隆pMD-M123和pMD-M456。
用引物对prsv5F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv3400R分别从质粒pMD-M123和pMD-M456上扩增片段123a和片段456a，将片段123a和片段456a进行套叠PCR扩增获得片段1-6。同上进行T-A克隆，获得含6个突变位点的亚克隆pMD-M1-6。
1.2.4 4种PRSV-LM弱毒突变体的构建 （1）构建弱毒突变体pGprsvm6：用引物prsv5F-25ov和prsv3400R从质粒pMD-M1-6上扩增片段1-6a；用引物prsv3376F和prsv3R-33T从质粒pPRSV-LM上扩增PRSV片段B；用引物pGr35S-prsF和pGr35S-R1从质粒pGreenII-35S上扩增载体片段C，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段1-6a、B和C。利用Gibson拼接法[31]将片段1-6a、B和C进行体外连接，具体操作参照说明书，然后电击转化农杆菌感受态细胞C58C1（含pSoup辅助质粒），涂布含有50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素和20 mg/L庆大霉素的LB平板，28 ℃条件下倒置培养2～3 d，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，对初步鉴定出的阳性克隆进行测序，测序正确的弱毒突变体可用于后续接种实验。
（2）构建弱毒突变体pGprsvm4：用引物对prsv5F-25ov、prsv2342F/L-R从质粒pMD-M1-6上扩增片段P1；分别用引物prsv2342F/L-F、prsv2915D/N-R和prsv2915D/N-F、prsv3R-33T从质粒pPRSV-LM上扩增片段P2和P3；然后将片段P1和P2进行套叠PCR扩增片段P12，再将片段P12、P3和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
（3）构建弱毒突变体pGprsvm2：分别用引物prsv5F-25ov和prsv2345L/I-R、prsv2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv3400R从质粒pPRSV-LM上扩增片段F1、F2和F3，片段F2和F3套叠PCR扩增片段F23，随后片段F1和F23套叠PCR扩增片段F123，再将片段F123、B和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
（4）构建弱毒突变体pGprsvm8：分别用引物prsv5F-25ov和prsv1877K/E-R、prsv1877K/E-F prsv2268R/I-R、prsv2268R/I-F和prsv3R-33T从质粒pGprsvm6上扩增片段N1、N2和N3，片段N1和N2套叠PCR扩增片段N12，然后将片段N12、N3和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
1.2.5 4种弱毒突变体侵染性检测及接种后病症状况观察 将构建的4种PRSV-LM的弱毒突变体（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）及对照组（阳性对照CK+为强毒株侵染性克隆pPRSV-LM，阴性对照CK-为转化空载体pGreenII-35S的农杆菌克隆）分别接种生长至20～30 cm的非转基因番木瓜植株上，每组至少接种10株番木瓜苗，进行3次重复实验。农杆菌注射接种的方法主要参考Youssef等[30]的方法。 接种后的番木瓜苗在温室中（25～28 ℃，光照12 h）培养，每周观察其生长情况并进行拍照。在接种4周后，取第2片或第3片叶（非接种叶片，叶片长约1 cm为第1片叶）约50 mg，用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，用PRSV特异引物prsv613-F和prsv613-R（见表1）进行RT-PCR检测，且对PCR产物进行测序分析，从而验证构建的4种PRSV-LM的弱毒突变体是否具有侵染性。
2 结果与分析
2.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列的比对分析
33个马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株之间的氨基酸序列比对结果见图1，根据Chiang等[32]的研究结果显示，决定PRSV HA5-1为弱毒株的关键位点是全长氨基酸序列的第309、481、753和944位氨基酸。PRSV弱毒株HA5-1与其他强弱毒株的比对结果也表明，第753位氨基酸在马铃薯Y病毒属病毒中是非常保守的，除弱毒株HA5-1和强毒株PVA（NP_659729）在该位点为亮氨酸（L）外，其他病毒分离物均为苯丙氨酸（F）；第309、481和944位氨基酸虽在马铃薯Y病毒属病毒中不保守，但在PRSV株系中具有较高的保守性。如在第309位，PRSV弱毒株HA5-1为丝氨酸（S），除巴西PRSV强毒株（AKL72309）为亮氨酸（L）外，其他PRSV强毒株的分离物均为异亮氨酸（I）；第481位，夏威夷PRSV强毒株（ABV53466）和弱毒株HA5-1为谷氨酰胺（Q），其他PRSV强毒株分离物均为赖氨酸（K）；在第944位，弱毒株HA5-1为天冬酰胺（N），除海南PRSV分离物（AHG9158）为谷氨酸（E）外，其他PRSV强毒株分离物均为天冬氨酸（D）。由此，将以上4个氨基酸位点作为弱毒株构建的候选突变位点。Gal-On[33]、 Lin等[34]研究结果表明ZYMV的HC-Pro基因上的FRNK保守结构域中精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）时，严重影响其病症表现。而且本研究比對结果也表明，在该位点仅ZYMV弱毒株WK为I，其他病毒分离物均为保守的R，即第728位氨基酸是决定ZYMV WK弱毒株的关键位点，故作为本研究的候选突变位点（图1）。根据Nakazono-Nagaoka等[12]的研究结果发现BYMV弱毒株M11与亲本强毒株IbG之间差异的关键位点是第314位氨基酸，结合比对分析结果，选定第754位和第787位氨基酸进行候选突变位点。Atreya等[35]、 Huet等[36]报道TVMV的HC-Pro基因上的KITC保守结构域中赖氨酸（K）突变为谷氨酸（E）时，会影响病毒的积累和病症表现，而且丧失蚜虫传播的能力。比对结果也显示该位点在马铃薯Y病毒属病毒中也是非常保守的，故第598位氨基酸也作为本研究的突变候选位点。根据比对分析选定的以上8个候选氨基酸突变位点，确定构建4种分别含2、4、6、8个氨基酸突变位点的PRSV-LM全长cDNA侵染性克隆突变体。
2.2 亚克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的构建
PCR扩增获得含相应突变位点的6个小片段1、2、3、4、5、6（图2），片段1、2、3和片段4、5、6分别套叠PCR扩增得到片段123和片段456（图2），经T-A克隆，成功获得含突变位点的亚克隆pMD-M123和pMD-M456（图3-B）。以亚克隆pMD-M123和pMD-M456为模板，PCR扩增获得片段123a和片段456a（图2），片段123a和片段456a经套叠PCR扩增得到片段1-6，经T-A克隆，成功获得含6个突变位点（I309→S、 K481→Q、 F753→L、 L754→I、N787→S和D944→N）的亚克隆pMD-M1-6（图3-B）。
2.3 4种PRSV-LM的弱毒突变体的构建
构建弱毒突变体pGprsvm6：PCR扩增获得3个片段1-6a、B和C（图4-a），经Gibson拼接成功构建含6个氨基酸位点突变（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的弱毒突变体pGprsvm6（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm4：PCR扩增获得片段P1、P2和P3（图4-b），片段P1和P2经套叠PCR扩增获得片段P12，3个片段P12、P3和C经Gibson拼接成功构建含4个氨基酸位点突变（I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N）的弱毒突变体pGprsvm4（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm2：PCR扩增获得片段F1、F2和F3（图4-c），片段F2和F3经套叠PCR扩增得到片段F23，然后片段F1和F23经套叠PCR扩增得到片段F123，3个片段F123、B和C经Gibson拼接成功构建含2个氨基酸位点突变（L754→I和N787→S）的弱毒突变体pGprsvm2（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm8：PCR扩增获得片段N1、N2和N3（图4-d），片段N1和N2经套叠PCR扩增获得片段N12，3个片段N12、N3和C经Gibson拼接成功构建含8个氨基酸位点突变（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）弱毒突变体pGprsvm8（图3-C）。
2.4 4种PRSV-LM的弱毒突变体接种番木瓜后的侵染性检测及病症表现分析
接种4周后，对实验组和对照组的非接种新生叶片进行RT-PCR检测，4种弱毒突变体和阳性对照组均能检测出613 bp目的条带（图5），且PCR产物测序结果正确。结果表明：4种弱毒突变体pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6、pGprsvm8和阳性对照组pPRSV-LM均能系统性侵染番木瓜植株，且侵染效率达100%，而阴性对照组pGreenII-35S不能侵染番木瓜（图3-C）。 各实验组和对照组在接种3周后，在番木瓜植株上无明显病症发生。阳性对照组pPRSV-LM和含2个位点突变的弱毒突变体pGprsvm2在接种番木瓜苗4周后，植株开始表现出轻微的叶脉褪绿、透化，叶片黄化，茎杆出现水渍等病症，随后病症逐渐加重，接种6周后叶片出现皱缩、畸形，至第10周时，叶片严重畸形，植株开始出现停滞生长，甚至无法长出新叶（图6）。含4个位点突变的弱毒突变体pGprsvm4和含6个位点突变的弱毒突变体pGprsvm6在接种4周后，也开始出现轻微病症，直至第10周，仅出现花叶、叶片局部畸形、茎杆少量水渍状等，均表现出较阳性对照组轻微的病症，且弱毒突变体pGprsvm6表现的病症要比弱毒突变体pGprsvm4的弱（图6）。含8个位点突变的弱毒突变体pGprsvm8仅在接种8周后才出现叶脉轻度透化、叶片轻微褪绿、茎杆无明显水渍状等，直至第10周，病症也未出现加重，长势较好，基本不影响生长，其病症表现比弱毒突变体pGprsvm6弱很多（图6）。而接种空载体pGreenII-35S的阴性对照组在接种10周后仍健康生长，无任何病症表现（图6）。经过接种后10周的观察，发现弱毒突变体pGprsvm2和阳性对照组亲本毒株pPRSV-LM的病症相当，最为严重；弱毒突变体pGprsvm4次之，病症较弱；弱毒突变体pGprsvm6再次之，病症很弱；弱毒突变体pGprsvm8会延迟发病，且病症最弱，症状不明显；接种空载体pGreenII-35S的阴性对照组无任何病症表现（图6）。
2.5 影响PRSV-LM致病性的相关位点分析
本研究4种PRSV-LM的弱毒突变体（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）接种番木瓜的病症发生结果显示：除含L754→I和N787→S两个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm2发病情况与亲本强毒株PRSV-LM相似外，其他多位点突变的弱毒突变体pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上症状都有不同程度的减弱，而弱毒突变体pGprsvm8的病症最弱，且可延迟2周发病。初步说明I309→S、K481→Q、K598→E、F753→L、R728→I和D944→N這6个氨基酸位点的改变与PRSV-LM的病症表现及致病力相关，其中K598→E和R728→I两个位点对其致病力的影响是至关重要的，而L754→I和N787→S两个位点的改变对其病症表现影响不显著。
3 讨论
3.1 PRSV-LM毒力弱化的相关位点分析
4种PRSV-LM的弱毒突变体接种番木瓜苗后10周的病症观察显示，含L754→I和N787→S两个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm2仍表现出与亲本强毒株PRSV-LM类似的症状，可见L754和N787两个位点的氨基酸的改变不影响病症表现。含I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N这4个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm4在番木瓜植株上的症状明显减弱，该结果验证了Chiang等[32]的报道，决定PRSV弱毒株HA5-1是位于P1和HC-Pro基因上的第309、481、753和944位氨基酸。本实验中含8个氨基酸位点突变的克隆pGprsvm8比含6或4个位点突变的弱毒突变体pGprsvm6和pGprsvm4的病症显著减弱，且延迟发病，表明K598→E和R728→I的突变对PRSV-LM的致病性有重大影响。这与Gal-On[33]、 Lin等[34的研究结果一致，发现决定ZYMV弱毒株WK的关键位点是HC-Pro蛋白中第180位精氨酸突变为异亮氨酸R180→I（对应于PRSV全长氨基酸序列的第728位氨基酸R728→I）。由于该位点正位于保守结构FRNK上，第728位精氨酸在马铃薯Y病毒属病毒中高度保守（图1），故该位点的突变对PRSV至关重要。Atreya等[35]、 Huet等[36]发现TVMV的第307位赖氨酸突变为谷氨酸（对应于PRSV全长氨基酸序列的第598位氨基酸K598→E）时，会影响病毒的积累和病症表现，而且丧失蚜虫传播的能力。氨基酸序列比对结果显示，K598正位于保守结构域KITC上，在马铃薯Y病毒属病毒中具有较高保守性。虽然含K598→E和R728→I突变的克隆pGprsvm8不能分别证明这2个位点对其致病性的影响，但也验证了K598和R728是决定PRSV-LM致病性和病症表现的关键位点。此外，K598→E该位点的突变是否影响蚜虫传播能力有待进一步实验验证，这将为后续弱毒株的交叉保护应用具有重要意义。
3.2 交叉保护弱毒株的获取及应用
利用交叉保护防治植物病毒病害最关键的是弱毒株的获得。目前，弱毒株的获得通常有以下几种途径： （1）从自然界中筛选，如在病毒危害严重的田间植株中筛选获得[37]；（2）通过化学和物理方法诱变，如用亚硝酸盐[38]和紫外线直接处理强毒病毒获得； （3）通过温度诱变获得[39]；（4）通过反向遗传学技术获得[40]。
随着对病毒致病机理的深入研究，利用反向遗传学技术在明确调控病毒致病性的氨基酸位点的基础上，通过定点突变的方法构建病毒全长侵染性克隆突变体，筛选获得病症显著减弱的弱毒株系，这比从自然界中筛选或是物理化学因素诱变后筛选更为简单有效。也有研究结果表明，对特定的某个位点的核苷酸进行突变后，发生回复突变、恢复原有致病力的几率很小[34]，从而大大降低了弱毒株在应用交叉保护过程中突变为强毒株的风险。虽然弱毒株的交叉保护作用也存在一些缺陷，如交叉保护存在的株系专化性问题[28]、作物和品种问题[41]、弱毒株系与其他病毒有协生作用的风险[42]。但相比转基因、药物防治及栽培管理防治，植物病毒的交叉保护作用具有多抗、高抗和卫生安全等优点，防治效果更为有效。因此，本研究选择PRSV弱毒株的获取途径是利用反向遗传学技术，对与PRSV-LM毒力弱化的相关位点进行定点突变，从而构建了4种PRSV的弱毒突变体。 在構建的4种PRSV弱毒突变体克隆中，弱毒突变体pGprsvm8侵染的木瓜苗经过10周的病症观察发现未出现明显的病症，长势与阴性对照组相近，通过RT-PCR检测出弱毒突变体pGprsvm8能够系统的感染番木瓜，并控温25 ℃的条件下观察弱毒株的病症状况，避免了病毒高温隐症所带来的误导[43]。本研究构建的弱毒突变体pGprsvm8可作为理想型的弱毒株用于后续的交叉保护实验，为后续交叉保护实验的开展奠定了基础，同时为其他马铃薯Y病毒属病毒弱毒株的构建提供理论和实践依据。
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关键词 番木瓜环斑病毒；弱毒株；定点突变；交叉保护
中图分类号 Q949.759.6 文献标识码 A
番木瓜（Carica papaya L.）又称木瓜、乳瓜、万寿果，是热带、亚热带重要的经济果蔬之一。番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒，是威胁番木瓜种植产业发展最为严重的病害[1]。目前，番木瓜环斑病还没有根治的办法，仅采取选育抗病新品种，且结合栽培技术为主的综合防治措施。主要从选种耐病品种、改进栽培管理措施、消灭传毒介体、化学防治、及时砍除病株、利用弱毒系防治病毒病害及空间避病这些手段进行防预[2]。然而，选育耐病或抗病品种的方法并不理想，栽培管理方面又需耗费巨大的人力、财力和时间。因此，急需寻求一种环境友好、高效便捷、应用前景广的防控PRSV的新方法。
交叉保护（mild strains cross protection， MSCP）是防治植物病毒病为害的一种重要的有效方法，是指一种病毒侵染植株后防止相同病毒的不同株系或亲缘关系相近的另外一种病毒的侵染[3]。McKinney[4]于1929年首次发现烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）在烟草上存在交叉保护现象。随后，交叉保护作用在植物病毒上有研究报道，如辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）[5]、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）[6]、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）[7]、日本山药花叶病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）[8]、苹果花叶病毒（Apple mosaic virus，ApMV）[9]、李痘病毒（Plum pox virus， PPV）[10]、 花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus， CaMV）[11]、 菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus， BYMV）[12]、可可肿枝病毒（Cocoa swollen shoot virus， CSSV）[13]、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）[14]、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）[15]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）[16]、 TMV[17]和PRSV[18]等， 目前，已大规模商业化应用于生产实践的有TMV[19]、 CTV[20-21]、 PRSV[22-23]和ZYMV[15]。
早在20世纪80年代，利用亚硝酸诱变美国夏威夷的番木瓜环斑病毒强毒株HA获得其弱毒株HA5-1并进行交叉保护防控PRSV研究，在中国台湾和美国佛罗里达、夏威夷等地区得到很好的推广应用[22， 24]。但弱株系的保护作用存在株系专化性问题[25-26]，如HA5-1弱株系对夏威夷野生株系的保护作用比对中国台湾株系的强[27]，对中国华南地区PRSV株系的保护作用很差[25]，对泰国株系和墨西哥株系没有保护作用[26]。进一步的研究结果表明，PRSV株系间的交互保护作用程度与株系间的亲缘关系呈正相关[25， 28]。因此，从当地的PRSV株系中选择一个优势株系进行诱变筛选弱株系是一种最佳做法。本研究利用反向遗传学技术对马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株的氨基酸序列进行比对分析，旨在筛选出决定致病性的关键位点，采用定点突变海南PRSV强毒株LM的方法，快速构建、筛选病症显著减弱的弱毒株，用于后续交叉保护效果研究，以期防控危害海南地区番木瓜种植产业最为严重的PRSV病毒病。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 PRSV强毒株LM（登录号：KT633943）由本实验室从混合感染的番木瓜样品中分离、保存，并构建其全长cDNA侵染性克隆pPRSV-LM[29]。非转基因番木瓜（Solo）由本实验室保存。
1.1.2 菌株及载体 大肠杆菌感受态Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司；本实验使用的农杆菌C58C1（携带pSoup辅助质粒）由法国Thierry Candresse[30]实验室惠赠；构建侵染性克隆的载体pGreenII-35S（登录号：KX826944）由本实验室构建并保存。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。 1.1.3 主要試剂 高保真酶Prime STAR HS（Premix）、 Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）、 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、 PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit均购自TaKaRa公司； Trizol购自Thermo Fisher Scientific公司； Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列多重比对分析 本研究共选用33个马铃薯Y病毒属病毒（强、弱毒株）的全长或部分氨基酸序列进行比对分析（图1），包括15个PRSV的分离物和18个其他马铃薯Y病毒属病毒分离物，其中3个弱毒株：夏威夷PRSV强毒株HA经化学诱变获得的弱毒株HA 5-1，法国从自然界筛选获得的ZYMV弱毒株WK和日本的BYMV弱毒株M11。使用Vector NTI advance 11软件进行氨基酸序列多重比对分析。
1.2.2 引物设计合成及测序 根据PRSV-LM全长基因组序列、pGreenII-35S载体序列及8个突变位点，利用Verctor NTI advance 11软件，设计Gibson拼接法构建4种PRSV-LM弱毒突变体的引物（表1），引物合成和测序均由上海立菲生物技术有限公司完成。
1.2.3 亚克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的构建 用引物对prsv5F和prsv1011I/S-R、prsv1011I/S-F和prsv1526K/Q-R、prsv1526K/Q-F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv2915D/N-R、prsv2915D/N-F和prsv3400R从质粒pPRSV-LM上分别扩增含突变位点（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的6个小片段1、2、3、4、5、6。将片段1、2、3和片段4、5、6分别进行套叠PCR扩增，结果获得片段123和片段456，经加A处理后分别连接至pMD18-T载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌感受态Trans5α，经菌液PCR和测序鉴定分析，获得亚克隆pMD-M123和pMD-M456。
用引物对prsv5F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv3400R分别从质粒pMD-M123和pMD-M456上扩增片段123a和片段456a，将片段123a和片段456a进行套叠PCR扩增获得片段1-6。同上进行T-A克隆，获得含6个突变位点的亚克隆pMD-M1-6。
1.2.4 4种PRSV-LM弱毒突变体的构建 （1）构建弱毒突变体pGprsvm6：用引物prsv5F-25ov和prsv3400R从质粒pMD-M1-6上扩增片段1-6a；用引物prsv3376F和prsv3R-33T从质粒pPRSV-LM上扩增PRSV片段B；用引物pGr35S-prsF和pGr35S-R1从质粒pGreenII-35S上扩增载体片段C，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段1-6a、B和C。利用Gibson拼接法[31]将片段1-6a、B和C进行体外连接，具体操作参照说明书，然后电击转化农杆菌感受态细胞C58C1（含pSoup辅助质粒），涂布含有50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素和20 mg/L庆大霉素的LB平板，28 ℃条件下倒置培养2～3 d，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，对初步鉴定出的阳性克隆进行测序，测序正确的弱毒突变体可用于后续接种实验。
（2）构建弱毒突变体pGprsvm4：用引物对prsv5F-25ov、prsv2342F/L-R从质粒pMD-M1-6上扩增片段P1；分别用引物prsv2342F/L-F、prsv2915D/N-R和prsv2915D/N-F、prsv3R-33T从质粒pPRSV-LM上扩增片段P2和P3；然后将片段P1和P2进行套叠PCR扩增片段P12，再将片段P12、P3和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
（3）构建弱毒突变体pGprsvm2：分别用引物prsv5F-25ov和prsv2345L/I-R、prsv2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv3400R从质粒pPRSV-LM上扩增片段F1、F2和F3，片段F2和F3套叠PCR扩增片段F23，随后片段F1和F23套叠PCR扩增片段F123，再将片段F123、B和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
（4）构建弱毒突变体pGprsvm8：分别用引物prsv5F-25ov和prsv1877K/E-R、prsv1877K/E-F prsv2268R/I-R、prsv2268R/I-F和prsv3R-33T从质粒pGprsvm6上扩增片段N1、N2和N3，片段N1和N2套叠PCR扩增片段N12，然后将片段N12、N3和载体片段C进行Gibson拼接，后续实验步骤同1.2.4（1）。
1.2.5 4种弱毒突变体侵染性检测及接种后病症状况观察 将构建的4种PRSV-LM的弱毒突变体（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）及对照组（阳性对照CK+为强毒株侵染性克隆pPRSV-LM，阴性对照CK-为转化空载体pGreenII-35S的农杆菌克隆）分别接种生长至20～30 cm的非转基因番木瓜植株上，每组至少接种10株番木瓜苗，进行3次重复实验。农杆菌注射接种的方法主要参考Youssef等[30]的方法。 接种后的番木瓜苗在温室中（25～28 ℃，光照12 h）培养，每周观察其生长情况并进行拍照。在接种4周后，取第2片或第3片叶（非接种叶片，叶片长约1 cm为第1片叶）约50 mg，用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA，使用反转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，用PRSV特异引物prsv613-F和prsv613-R（见表1）进行RT-PCR检测，且对PCR产物进行测序分析，从而验证构建的4种PRSV-LM的弱毒突变体是否具有侵染性。
2 结果与分析
2.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列的比对分析
33个马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株之间的氨基酸序列比对结果见图1，根据Chiang等[32]的研究结果显示，决定PRSV HA5-1为弱毒株的关键位点是全长氨基酸序列的第309、481、753和944位氨基酸。PRSV弱毒株HA5-1与其他强弱毒株的比对结果也表明，第753位氨基酸在马铃薯Y病毒属病毒中是非常保守的，除弱毒株HA5-1和强毒株PVA（NP_659729）在该位点为亮氨酸（L）外，其他病毒分离物均为苯丙氨酸（F）；第309、481和944位氨基酸虽在马铃薯Y病毒属病毒中不保守，但在PRSV株系中具有较高的保守性。如在第309位，PRSV弱毒株HA5-1为丝氨酸（S），除巴西PRSV强毒株（AKL72309）为亮氨酸（L）外，其他PRSV强毒株的分离物均为异亮氨酸（I）；第481位，夏威夷PRSV强毒株（ABV53466）和弱毒株HA5-1为谷氨酰胺（Q），其他PRSV强毒株分离物均为赖氨酸（K）；在第944位，弱毒株HA5-1为天冬酰胺（N），除海南PRSV分离物（AHG9158）为谷氨酸（E）外，其他PRSV强毒株分离物均为天冬氨酸（D）。由此，将以上4个氨基酸位点作为弱毒株构建的候选突变位点。Gal-On[33]、 Lin等[34]研究结果表明ZYMV的HC-Pro基因上的FRNK保守结构域中精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）时，严重影响其病症表现。而且本研究比對结果也表明，在该位点仅ZYMV弱毒株WK为I，其他病毒分离物均为保守的R，即第728位氨基酸是决定ZYMV WK弱毒株的关键位点，故作为本研究的候选突变位点（图1）。根据Nakazono-Nagaoka等[12]的研究结果发现BYMV弱毒株M11与亲本强毒株IbG之间差异的关键位点是第314位氨基酸，结合比对分析结果，选定第754位和第787位氨基酸进行候选突变位点。Atreya等[35]、 Huet等[36]报道TVMV的HC-Pro基因上的KITC保守结构域中赖氨酸（K）突变为谷氨酸（E）时，会影响病毒的积累和病症表现，而且丧失蚜虫传播的能力。比对结果也显示该位点在马铃薯Y病毒属病毒中也是非常保守的，故第598位氨基酸也作为本研究的突变候选位点。根据比对分析选定的以上8个候选氨基酸突变位点，确定构建4种分别含2、4、6、8个氨基酸突变位点的PRSV-LM全长cDNA侵染性克隆突变体。
2.2 亚克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的构建
PCR扩增获得含相应突变位点的6个小片段1、2、3、4、5、6（图2），片段1、2、3和片段4、5、6分别套叠PCR扩增得到片段123和片段456（图2），经T-A克隆，成功获得含突变位点的亚克隆pMD-M123和pMD-M456（图3-B）。以亚克隆pMD-M123和pMD-M456为模板，PCR扩增获得片段123a和片段456a（图2），片段123a和片段456a经套叠PCR扩增得到片段1-6，经T-A克隆，成功获得含6个突变位点（I309→S、 K481→Q、 F753→L、 L754→I、N787→S和D944→N）的亚克隆pMD-M1-6（图3-B）。
2.3 4种PRSV-LM的弱毒突变体的构建
构建弱毒突变体pGprsvm6：PCR扩增获得3个片段1-6a、B和C（图4-a），经Gibson拼接成功构建含6个氨基酸位点突变（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的弱毒突变体pGprsvm6（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm4：PCR扩增获得片段P1、P2和P3（图4-b），片段P1和P2经套叠PCR扩增获得片段P12，3个片段P12、P3和C经Gibson拼接成功构建含4个氨基酸位点突变（I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N）的弱毒突变体pGprsvm4（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm2：PCR扩增获得片段F1、F2和F3（图4-c），片段F2和F3经套叠PCR扩增得到片段F23，然后片段F1和F23经套叠PCR扩增得到片段F123，3个片段F123、B和C经Gibson拼接成功构建含2个氨基酸位点突变（L754→I和N787→S）的弱毒突变体pGprsvm2（图3-C）。
构建弱毒突变体pGprsvm8：PCR扩增获得片段N1、N2和N3（图4-d），片段N1和N2经套叠PCR扩增获得片段N12，3个片段N12、N3和C经Gibson拼接成功构建含8个氨基酸位点突变（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）弱毒突变体pGprsvm8（图3-C）。
2.4 4种PRSV-LM的弱毒突变体接种番木瓜后的侵染性检测及病症表现分析
接种4周后，对实验组和对照组的非接种新生叶片进行RT-PCR检测，4种弱毒突变体和阳性对照组均能检测出613 bp目的条带（图5），且PCR产物测序结果正确。结果表明：4种弱毒突变体pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6、pGprsvm8和阳性对照组pPRSV-LM均能系统性侵染番木瓜植株，且侵染效率达100%，而阴性对照组pGreenII-35S不能侵染番木瓜（图3-C）。 各实验组和对照组在接种3周后，在番木瓜植株上无明显病症发生。阳性对照组pPRSV-LM和含2个位点突变的弱毒突变体pGprsvm2在接种番木瓜苗4周后，植株开始表现出轻微的叶脉褪绿、透化，叶片黄化，茎杆出现水渍等病症，随后病症逐渐加重，接种6周后叶片出现皱缩、畸形，至第10周时，叶片严重畸形，植株开始出现停滞生长，甚至无法长出新叶（图6）。含4个位点突变的弱毒突变体pGprsvm4和含6个位点突变的弱毒突变体pGprsvm6在接种4周后，也开始出现轻微病症，直至第10周，仅出现花叶、叶片局部畸形、茎杆少量水渍状等，均表现出较阳性对照组轻微的病症，且弱毒突变体pGprsvm6表现的病症要比弱毒突变体pGprsvm4的弱（图6）。含8个位点突变的弱毒突变体pGprsvm8仅在接种8周后才出现叶脉轻度透化、叶片轻微褪绿、茎杆无明显水渍状等，直至第10周，病症也未出现加重，长势较好，基本不影响生长，其病症表现比弱毒突变体pGprsvm6弱很多（图6）。而接种空载体pGreenII-35S的阴性对照组在接种10周后仍健康生长，无任何病症表现（图6）。经过接种后10周的观察，发现弱毒突变体pGprsvm2和阳性对照组亲本毒株pPRSV-LM的病症相当，最为严重；弱毒突变体pGprsvm4次之，病症较弱；弱毒突变体pGprsvm6再次之，病症很弱；弱毒突变体pGprsvm8会延迟发病，且病症最弱，症状不明显；接种空载体pGreenII-35S的阴性对照组无任何病症表现（图6）。
2.5 影响PRSV-LM致病性的相关位点分析
本研究4种PRSV-LM的弱毒突变体（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）接种番木瓜的病症发生结果显示：除含L754→I和N787→S两个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm2发病情况与亲本强毒株PRSV-LM相似外，其他多位点突变的弱毒突变体pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上症状都有不同程度的减弱，而弱毒突变体pGprsvm8的病症最弱，且可延迟2周发病。初步说明I309→S、K481→Q、K598→E、F753→L、R728→I和D944→N這6个氨基酸位点的改变与PRSV-LM的病症表现及致病力相关，其中K598→E和R728→I两个位点对其致病力的影响是至关重要的，而L754→I和N787→S两个位点的改变对其病症表现影响不显著。
3 讨论
3.1 PRSV-LM毒力弱化的相关位点分析
4种PRSV-LM的弱毒突变体接种番木瓜苗后10周的病症观察显示，含L754→I和N787→S两个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm2仍表现出与亲本强毒株PRSV-LM类似的症状，可见L754和N787两个位点的氨基酸的改变不影响病症表现。含I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N这4个氨基酸位点突变的弱毒突变体pGprsvm4在番木瓜植株上的症状明显减弱，该结果验证了Chiang等[32]的报道，决定PRSV弱毒株HA5-1是位于P1和HC-Pro基因上的第309、481、753和944位氨基酸。本实验中含8个氨基酸位点突变的克隆pGprsvm8比含6或4个位点突变的弱毒突变体pGprsvm6和pGprsvm4的病症显著减弱，且延迟发病，表明K598→E和R728→I的突变对PRSV-LM的致病性有重大影响。这与Gal-On[33]、 Lin等[34的研究结果一致，发现决定ZYMV弱毒株WK的关键位点是HC-Pro蛋白中第180位精氨酸突变为异亮氨酸R180→I（对应于PRSV全长氨基酸序列的第728位氨基酸R728→I）。由于该位点正位于保守结构FRNK上，第728位精氨酸在马铃薯Y病毒属病毒中高度保守（图1），故该位点的突变对PRSV至关重要。Atreya等[35]、 Huet等[36]发现TVMV的第307位赖氨酸突变为谷氨酸（对应于PRSV全长氨基酸序列的第598位氨基酸K598→E）时，会影响病毒的积累和病症表现，而且丧失蚜虫传播的能力。氨基酸序列比对结果显示，K598正位于保守结构域KITC上，在马铃薯Y病毒属病毒中具有较高保守性。虽然含K598→E和R728→I突变的克隆pGprsvm8不能分别证明这2个位点对其致病性的影响，但也验证了K598和R728是决定PRSV-LM致病性和病症表现的关键位点。此外，K598→E该位点的突变是否影响蚜虫传播能力有待进一步实验验证，这将为后续弱毒株的交叉保护应用具有重要意义。
3.2 交叉保护弱毒株的获取及应用
利用交叉保护防治植物病毒病害最关键的是弱毒株的获得。目前，弱毒株的获得通常有以下几种途径： （1）从自然界中筛选，如在病毒危害严重的田间植株中筛选获得[37]；（2）通过化学和物理方法诱变，如用亚硝酸盐[38]和紫外线直接处理强毒病毒获得； （3）通过温度诱变获得[39]；（4）通过反向遗传学技术获得[40]。
随着对病毒致病机理的深入研究，利用反向遗传学技术在明确调控病毒致病性的氨基酸位点的基础上，通过定点突变的方法构建病毒全长侵染性克隆突变体，筛选获得病症显著减弱的弱毒株系，这比从自然界中筛选或是物理化学因素诱变后筛选更为简单有效。也有研究结果表明，对特定的某个位点的核苷酸进行突变后，发生回复突变、恢复原有致病力的几率很小[34]，从而大大降低了弱毒株在应用交叉保护过程中突变为强毒株的风险。虽然弱毒株的交叉保护作用也存在一些缺陷，如交叉保护存在的株系专化性问题[28]、作物和品种问题[41]、弱毒株系与其他病毒有协生作用的风险[42]。但相比转基因、药物防治及栽培管理防治，植物病毒的交叉保护作用具有多抗、高抗和卫生安全等优点，防治效果更为有效。因此，本研究选择PRSV弱毒株的获取途径是利用反向遗传学技术，对与PRSV-LM毒力弱化的相关位点进行定点突变，从而构建了4种PRSV的弱毒突变体。 在構建的4种PRSV弱毒突变体克隆中，弱毒突变体pGprsvm8侵染的木瓜苗经过10周的病症观察发现未出现明显的病症，长势与阴性对照组相近，通过RT-PCR检测出弱毒突变体pGprsvm8能够系统的感染番木瓜，并控温25 ℃的条件下观察弱毒株的病症状况，避免了病毒高温隐症所带来的误导[43]。本研究构建的弱毒突变体pGprsvm8可作为理想型的弱毒株用于后续的交叉保护实验，为后续交叉保护实验的开展奠定了基础，同时为其他马铃薯Y病毒属病毒弱毒株的构建提供理论和实践依据。
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