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摘要[目的]通过降低试验药剂、减少PCR循环时间、提高琼脂糖利用指数等,建立经济、快速、低污染的杂交水稻纯度鉴定体系。[方法]将杂交水稻万优481、亲本万3A和万恢481在光照培养箱内温度发芽(30 ℃,长到5 cm左右),用CTAB法提取DNA;按优化的PCR体系和电泳方法,用亲本万3A和万恢481的DNA从24对引物中筛选出多态性好的引物P18,用引物P18对杂交水稻万优481样本进行纯度鉴定。[结果]利用优化的SSR分子标记技术准确鉴定出万优481的纯度为98.5%,与田间鉴定结果相符,凝胶电泳成像带谱清晰,同时,与常用方法相比,酶等试验药品使用量减少20%~25%,试验所用时间较常用方法减少了50%以上。[结论]利用优化的SSR分子标记技术体系鉴定杂交水稻种子纯度,经济、快速且鉴定的结果清晰、可靠,同时大大减少琼脂糖等试验残渣的产生,降低了对环境污染,值得推广、应用。
关键词SSR分子标记;杂交水稻;纯度
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(2014)22-07321-02
纯度是杂交水稻种子质量的核心指标,是种子质量分级的主要标准,是企业购销种子的关键依据。准确、快速鉴定杂交水稻种子的纯度意义重大。然而,过去的田间鉴定需要大量的时间(至少90 d左右),随着DNA分子标记的兴起,利用DNA分子标记鉴定种子纯度大大减少了试验时间,但用常用的PCR扩增程序,做一板样品(96个样)仍需要2.5 h左右,凝胶电泳(96个样)也需要1.5 h以上,并不能完全满足目前高效的需要。SSR(Simple sequence repeats,简单序列重复)标记亦称微卫星(Microsatellite)标记,已被广泛用于各物种种群划分、杂种优势预测和农作物育种等领域[1-6]。随着农作物杂交种的广泛推广,SSR分子标记已被广泛用于水稻、玉米等杂交种子纯度鉴定[7-10]。由于杂交水稻种子的广泛应用,市场上的品种数目繁多,种子纯度鉴定工作量大、鉴定成本较高,笔者拟在常用SSR分子标记技术的基础上,对试验耗材用量和PCR等过程进一步优化,以达到节约成本、节省时间的效果,探索一套快速、低耗的SSR分子标记技术鉴定体系,为杂交水稻种子纯度鉴定提供快捷、可靠、低投入、少污染的方法。
1材料与方法
1.1试验材料重庆三峡农业科学院自制自繁种杂交水稻万优481及亲本万3A和万恢481。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取。将杂交水稻万优481(500粒)、亲本万3A(20粒)和万恢481(20粒)在光照培养箱内30 ℃下发芽至5 cm左右,然后用CTAB法提取DNA。
1.2.2PCR反应体系、反应程序及电泳方法的优化设计。PCR反应体系:20 ml体系包括dNTP 1.6 ml、PCR buffer2.0 ml、引物2.0 ml、模板DNA2.0 ml、Taq酶0.15 ml、水12.25 ml。
PCR反应程序: 94 ℃预变性5 min;94 ℃15 s,55 ℃15 s,72 ℃15 s,35个循环; 72 ℃ 3 min。
电泳方法优化:36孔子4排(24孔梳子4排),2次点样检测288个样(一次点样96个样)。
1.2.3筛选引物。利用亲本万3A、万恢481的DNA从24对引物中筛选出多态性好的引物P18,供试验使用。
1.2.4万优481纯度鉴定。利用筛选出来的引物P18对万优481群体经过PCR、琼脂糖凝胶电泳、成像,最后读带、统计,并计算出该批种子的纯度。
2结果与分析
2.1纯度鉴定结果用优化的SSR分子标记技术,对500株万恢481植株苗进行纯度鉴定,经读带统计,该批种子纯度为98.5%,与田间鉴定结果相符。
2.2优化的SSR分子标记技术试验效果利用优化的SSR分子标记技术进行引物筛选和纯度鉴定,最后成像带谱均较为清晰(图1),能够清楚地读出带谱,完全可以满足杂交水稻种子纯度鉴定工作。图1优化后的电泳成像效果2.3PCR耗材及效率分析在试验耗材方面,优化后的PCR体系较常用体系节省了20%的dNTP、20%的PCR buffer和25%的Taq酶,大幅降低了试验成本。
在试验用时上,利用优化后的反应程序扩增一板PCR只需要60 min,而常用反应程序扩增一板PCR则需要150 min左右,即利用优化后的PCR反应程序可以大大减少试验时间,提高了工作效率。
2.4电泳效率及琼脂糖利用指数分析传统的电泳方法,一次制胶只能做96个样品,用时90 min左右,折合1.07个/min样品,而优化后,一次制胶可以做出288个样品,用时130 min,折合2.22个/min样品,优化后的电泳效率为常用方法2倍多。同时大大减少制胶次数,节省了制胶所用成本。
关键词SSR分子标记;杂交水稻;纯度
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(2014)22-07321-02
纯度是杂交水稻种子质量的核心指标,是种子质量分级的主要标准,是企业购销种子的关键依据。准确、快速鉴定杂交水稻种子的纯度意义重大。然而,过去的田间鉴定需要大量的时间(至少90 d左右),随着DNA分子标记的兴起,利用DNA分子标记鉴定种子纯度大大减少了试验时间,但用常用的PCR扩增程序,做一板样品(96个样)仍需要2.5 h左右,凝胶电泳(96个样)也需要1.5 h以上,并不能完全满足目前高效的需要。SSR(Simple sequence repeats,简单序列重复)标记亦称微卫星(Microsatellite)标记,已被广泛用于各物种种群划分、杂种优势预测和农作物育种等领域[1-6]。随着农作物杂交种的广泛推广,SSR分子标记已被广泛用于水稻、玉米等杂交种子纯度鉴定[7-10]。由于杂交水稻种子的广泛应用,市场上的品种数目繁多,种子纯度鉴定工作量大、鉴定成本较高,笔者拟在常用SSR分子标记技术的基础上,对试验耗材用量和PCR等过程进一步优化,以达到节约成本、节省时间的效果,探索一套快速、低耗的SSR分子标记技术鉴定体系,为杂交水稻种子纯度鉴定提供快捷、可靠、低投入、少污染的方法。
1材料与方法
1.1试验材料重庆三峡农业科学院自制自繁种杂交水稻万优481及亲本万3A和万恢481。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取。将杂交水稻万优481(500粒)、亲本万3A(20粒)和万恢481(20粒)在光照培养箱内30 ℃下发芽至5 cm左右,然后用CTAB法提取DNA。
1.2.2PCR反应体系、反应程序及电泳方法的优化设计。PCR反应体系:20 ml体系包括dNTP 1.6 ml、PCR buffer2.0 ml、引物2.0 ml、模板DNA2.0 ml、Taq酶0.15 ml、水12.25 ml。
PCR反应程序: 94 ℃预变性5 min;94 ℃15 s,55 ℃15 s,72 ℃15 s,35个循环; 72 ℃ 3 min。
电泳方法优化:36孔子4排(24孔梳子4排),2次点样检测288个样(一次点样96个样)。
1.2.3筛选引物。利用亲本万3A、万恢481的DNA从24对引物中筛选出多态性好的引物P18,供试验使用。
1.2.4万优481纯度鉴定。利用筛选出来的引物P18对万优481群体经过PCR、琼脂糖凝胶电泳、成像,最后读带、统计,并计算出该批种子的纯度。
2结果与分析
2.1纯度鉴定结果用优化的SSR分子标记技术,对500株万恢481植株苗进行纯度鉴定,经读带统计,该批种子纯度为98.5%,与田间鉴定结果相符。
2.2优化的SSR分子标记技术试验效果利用优化的SSR分子标记技术进行引物筛选和纯度鉴定,最后成像带谱均较为清晰(图1),能够清楚地读出带谱,完全可以满足杂交水稻种子纯度鉴定工作。图1优化后的电泳成像效果2.3PCR耗材及效率分析在试验耗材方面,优化后的PCR体系较常用体系节省了20%的dNTP、20%的PCR buffer和25%的Taq酶,大幅降低了试验成本。
在试验用时上,利用优化后的反应程序扩增一板PCR只需要60 min,而常用反应程序扩增一板PCR则需要150 min左右,即利用优化后的PCR反应程序可以大大减少试验时间,提高了工作效率。
2.4电泳效率及琼脂糖利用指数分析传统的电泳方法,一次制胶只能做96个样品,用时90 min左右,折合1.07个/min样品,而优化后,一次制胶可以做出288个样品,用时130 min,折合2.22个/min样品,优化后的电泳效率为常用方法2倍多。同时大大减少制胶次数,节省了制胶所用成本。