论文部分内容阅读
目的:研究长链非编码RNA （lncRNA）-DNA损伤诱导的非编码RNA （NORAD）在食管癌Eca-109细胞中的表达,分析沉默NORAD通过miR-26a-5p/Unc-51样自噬激活激酶1 （ULK1）对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。方法:收集45例食管癌患者癌组织和40例癌旁正常组织标本,培养正常人食管鳞状上皮Het-1A细胞和食管癌Eca-109细胞,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测癌组织、癌旁正常组织、 Het-1A细胞和Eca-109细胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA表达水平。采用miRanda数据库检测NORAD与miR-26a-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测NORAD与miR-26a-5p的关系。根据实验目的和转染质粒的不同,Eca-109细胞分为siRNA NC组和NORAD siRNA组,inhibitor NC组和miR-26a-5p inhibitor组,pcDNA-3.1 （+）+mimics NC组、pcDNA-NORAD+mimics NC组、pcDNA-3.1（+）+miR-26a-5p mimics组和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）蛋白表达水平。采用TargetScan数据库检测miR-26a-5p与ULK1的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-26a-5p与ULK1的关系。Eca-109细胞分为siRNA NC组和ULK1siRNA组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。Eca-109细胞分为siRNA NC+inhibitor NC组、 NORAD siRNA+inhibitor NC组、 siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组,采用RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平。结果:与癌旁组织或Het-1A细胞比较,食管癌组织或Eca-109细胞中NORAD和ULK1 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,miR-26a-5p表达水平明显降低（P<0.01）。与siRNA NC组比较,NORAD siRNA组细胞活性明显降低（P<0.01）,侵袭细胞数明显减少（P<0.01）,细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,N-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。miRcode数据库和双荧光素酶报告基因检测,NORAD靶向miR-26a-5p。与inhibitor NC组比较,miR-26a-5p inhibitor组细胞活性明显升高（P<0.01）,侵袭细胞数明显增加（P<0.01）,细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）, N-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与pcDNA-3.1 （+）+miR-26a-5p mimics组比较,pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组细胞活性明显升高（P<0.01）,侵袭细胞数明显增加（P<0.01）,细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.01）,N-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。TargetScan数据库和双荧光素酶报告基因检测,miR-26a-5p靶向ULK1。与siRNA NC组比较,ULK1 siRNA组细胞活性明显降低（P<0.01）,侵袭细胞数明显减少（P<0.01）,细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,N-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组比较,NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结论:沉默lncRNA-NORAD可抑制Eca-109细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化（EMT）,其机制可能是通过调控miR-26a-5p/ULK1轴实现的。