【摘 要】
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目的 构建高效表达的DAZL重组腺病毒载体系统,观察DAZL基因对人脐带间充质干细胞(HUMSCs)向男性生殖细胞分化的影响.方法 1.用Gateway腺病毒系统制备含DAZL及EGFP基因的重组
【机 构】
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汕头大学医学院第二附属医院儿科,汕头大学医学院第二附属医院临床医学转化中心,广州市第一人民医院儿科
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目的 构建高效表达的DAZL重组腺病毒载体系统,观察DAZL基因对人脐带间充质干细胞(HUMSCs)向男性生殖细胞分化的影响.方法 1.用Gateway腺病毒系统制备含DAZL及EGFP基因的重组腺病毒pAd-DAZL-EGFP.2.用组织块贴壁法获得HUMSCs,用Ad-EGFP-DAZL感染第3代生长良好的HUMSCs,观察感染效率及细胞生长情况,确定最佳感染复数(MOI)和感染时间.3.通过形态学、反转录(RT)-PCR和免疫荧光鉴定DAZL基因异位表达诱导HUMSCs向男性生殖细胞方向分化的结果.结果 成功构建表达DAZL的腺病毒,病毒滴度为1.0×109 pfu/mL.最佳的感染条件为:MOI=100,感染时间=8h,该条件下的感染率为(43.00±1.52)％.HUMSCs在感染DAZL重组腺病毒后形态发生了明显的变化,第4-6天由成纤维细胞变成圆形,少数变圆的细胞在2～3周后变成蝌蚪状,阴性对照组及空白对照组细胞则未发生类似变化.RT-PCR和免疫荧光均证实实验组表达精原细胞的标志STELLA(DDPA3)、VASA(DDX4)、c-kit、DAZL和OCT4(POU5F1),阴性对照组及空白对照组则只表达内参基因.结论 DAZL重组腺病毒感染HUMSCs后能诱导HUMSCs向男性生殖细胞方向分化,证实DAZL基因是精子形成过程中的关键基因.
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