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摘要：研究水稻地方品种基因多样性可为优质种质资源的保护和选育新的品种提供理论依据。以太湖地区511份水稻地方品种为供试材料，选用19个与淀粉合成相關的基因内分子标记对其淀粉品质基因进行检测，并与86份育成品种作比较。结果发现：地方品种粳稻的平均多态信息含量（PIC）为0.172 6，稍高于育成品种粳稻的平均PIC值0.110 1。基于各材料间的Nei氏遗传距离，按照UPGMA方法进行聚类，所有研究材料被分为6个类群。第Ⅰ类群主要是籼稻，育成品种粳稻主要集中在第Ⅱ类群和第Ⅲ类群的上半段，地方品种粳稻主要集中在第Ⅲ类群下半段、第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ类群，二者分布在不同的区域，已出现遗传分化。分别依据国家优质米的标准，有众多太湖地区水稻地方品种属于品质性状比较优良的优质稻谷，这些品种可用于今后的品质育种。
关键词：太湖稻区；基因内分子标记；淀粉合成相关基因；多样性
中图分类号： S511.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0098-06
我国水稻选育品种的遗传基础狭窄问题已经比较严重，育成品种遗传多样性逐渐降低，育成亲本之间遗传差异非常接近[1-5]。大量推广遗传基础狭窄的品种，会对作物生产带来潜在风险。随着育种水平的不断提高，农作物品种推广的单一化趋势日益明显，造成大量基因的遗失和遗传多样性的降低[6-8]。金伟栋等利用60对SSR引物研究了太湖地区目前推广品种的遗传差异，品种间平均相似系数达0.902，其中武运粳7号和武运粳8号都无法分辨[9]。太湖流域早在 8 000年前就已开始稻作生产[10]，主要栽培粳稻。长期的自然演化和人工选择，形成该地区类型丰富的稻种资源[11-12]，它们在表型、抗（耐）特性及品质等方面各具特色，但是迄今在育种上利用的仅限于黄壳早廿日、矮宁黄和老虎稻等几个地方品种，绝大部分资源的利用潜力没有得到挖掘。
随着分子生物学技术的发展，目前已定位了一些与淀粉形成或与稻米品质形成有关的基因，这些基因主要包括颗粒淀粉合成酶基因（Wx）、分支酶基因（Sbe1、Sbe3）、可溶性淀粉合成酶基因（Sss1）、异淀粉酶基因（Isa）和极限糊精酶或R酶基因（Pull）等。吴洪恺等利用Wx基因对RVA谱进行研究，发现RVA的8个特征值的表现均起主要作用，对支链淀粉合成相关基因Sbe1、Sss1均表现明显的上位效应[13]。严长杰等以53个籼粳品种和近年育成的高产水稻品种为材料，设计Wx、Sbe1、Sbe3基因的分子标记，分析3个基因位点的遗传学效应。3个基因位点不同的等位基因对稻米淀粉的合成具有不同的遗传效应，其中Wx基因的影响最重要[14]。陈峰等利用Wx、Sbe1、Sbe3标记分析3个基因对稻米理化品质和RVA谱特征的效应，不同基因型品种间淀粉的理化特性（AC、GC、RVA）存在显著或极显著差异，而3个基因的联合效应在不同基因型组合间也存在显著的差异[15]。
金伟栋等利用微卫星标记（simple sequence repeat，SSR），对129个太湖流域粳稻地方品种资源核心种质进行了DNA分子水平的多态性分析，结果表明，太湖流域粳稻地方品种种质不仅具有丰富的遗传变异，同时保留了大量的稀有等位变异[9]。于萍等采用45对SSR引物对224份太湖流域粳稻地方品种进行遗传多样性分析，得出太湖流域粳稻地方品种SSR多样性较低、稀有类型等位基因较多的结论[16]。罗兵等利用SSR引物对太湖地区的42份粳稻品种进行遗传多样性分析，42份粳稻品种间的遗传相似系数平均为0.610 0，供试材料相似度高，每个多态位点的PIC值平均为0.496 6[17]。Debjani等利用36对SNP标记12条水稻染色体，对印度东北部地区的6 984份水稻品种进行遗传多样性分析，发现多态信息含量（PIC）的变幅为0.004～0.375，基因多样性的变幅为0.006～0.500[18]。Mehrzad等利用地方品种、纯系品种、育成品种和适应于Giulan省气候环境的外国品种为供试材料，采用分布在12对染色体上的52个引物来检测94份水稻基因型的遗传多样性，发现最高的和最低的PIC值分别为0892和0.423[19]。然而这些研究工作，所选的分子标记都是随机的，与性状的表现或相应的基因没有发生联系。因此，本研究选用与水稻品质关系密切的淀粉合成基因的内部标记，检测太湖流域水稻地方品种的标记基因型，并结合品质性状的表型，进行遗传多样性分析和评价。其次，基于各材料间的Nei氏遗传距离，按照UPGMA方法对511份水稻材料和86份水稻育成品种进行聚类，揭示太湖流域水稻地方品种资源的品质基因的遗传差异。研究结果可为保护稻种基因资源的多样性，充分利用优质基因，培育品质更为优良的水稻品种提供参考。
1 材料与方法
在江苏省苏州市农业科学院种植511个太湖地区水稻地方品种，其中粳稻423个、糯稻15个、粳糯39个、籼稻29个、籼糯5个以及86个来源广泛的育成品种（来自日本、美国和中国各地）。其中有个别品种名字相同但来源或者材料本身有差异，所以仍以相同的名字表示，但在相同的名字后面加了1，2……，以示区分。在幼苗期进行了取样和DNA提取，并在实验室进行基因内部标记（表1）的检测，这些标记位点共与19个淀粉合成基因有关。秋季，将这些材料分批收获，开展表观直链淀粉含量、胶稠度和糊化温度等品质性状的测定工作[20-21]。
1.1 标记基因型的检测
采用SDS方法提取DNA，再利用各标记相应的引物在各样本内进行PCR扩增，如果是CAPS分子标记，还需对PCR产物进行相应的酶切。PCR产物或酶切后产物经1%的琼脂糖凝胶或6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离不同大小的DNA片段。电泳条件选择的依据是多态性条带的差异大小，如大于50 bp，则选用琼脂糖凝胶，电泳后EB染色显带；小于 10 bp，则选用聚丙烯酰胺凝胶。电泳结束后用银染方法来显示DNA条带，结果用ScanMaker 3830扫描仪（Microtek，上海，中国）扫描。 1.2 统计分析
每1对引物检测1个位点，每1条多态性带为1个等位基因，对所有供试材料的等位基因进行记录。应用PowerMarker 3.25统计软件[22]进行一般统计量分析，获得等位变异数目、主效等位变异频率、基因多样性以及多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）[23]等参数值。进一步计算得到个体以及亚群间的Nei氏遗传距离矩阵，通过 UPGMA（unweighted pair group method with average）算法进行遗传聚类分析，并使用MEGA 4.0观察聚类图。
2 结果与分析
2.1 与淀粉合成相关基因多样性分析
对地方品种粳稻和育成品种粳稻进行对比分析，结果（表2）表明，地方品种粳稻的基因多样性平均为0.198 8，变幅为0.009 4～0.652 0，多态信息含量平均为0.172 6，变幅为0.009 4～0.588 7，其中（CT）n基因位点的多态性最高，Pull基因位点的多态性最低；而育成品种粳稻基因的多样性平均为0.128 2，变幅为0.000 0～0.511 6，多态信息含量平均为0.110 1，变幅为0.000 0～0.392 9，其中SSSⅢ-2基因位点的多态性最高，Wx、AATT、SSSⅥ-2基因位点的多态性最低。通过综合比较，地方品种粳稻比育成品种粳稻有较高的基因多样性和多态信息含量。
2.2 基于遗传距离聚类
基于各材料间的Nei氏遗传距离，按照UPGMA方法对511份水稻材料和86份水稻育成品种同时进行聚类分析，整个群体可以被分为6类（图1）。从聚类图来看，育成品种粳稻主要集中在第Ⅱ类群和第Ⅲ类群右上半段，地方品种粳稻主要集中在第Ⅲ类群下半段、第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ类群，二者位于不同的区域，已发生明显的遗传分化。第Ⅰ类群主要是籼稻地方品种。从聚类图中也发现，少数育成品种仍然夹杂在地方品种中，在等位基因组合上表现一致。如在树形图中，育成品种扬稻6号、水晶3号与地方品种水晶白稻、西石黄等在遗传距离上靠近；同样，育成品种武粳15与地方品种麻金糯、落霜青、田鸡青等在遗传距离上靠近。相反，少数地方品种也夹杂在育成品種中。如在树形图中，地方品种芦粳青、苏粳5号与育成品种淮稻11号、南粳44在遗传距离上靠近。这些结果表明，太湖地区的水稻种质资源中，少数地方品种与少数育成品种的相似系数较大，遗传差异较小，而大多地方品种资源与育成品种相似系数较小，位于不同的分支或群，遗传差异大。
2.3 品质性状的分类
表3、表4和表5是根据优质稻谷的国家标准[24]对地方品种进行的等级划分，对胶稠度性状，籼稻谷≥70 mm、粳稻谷≥80 mm、籼糯稻谷≥100 mm、粳糯稻谷≥100 mm为一级，从表4可以看出：从籼稻谷在胶稠度水平达到一级的有5个地方品种（桂圆黄、无锡稻等），占太湖地区地方品种总数的0.978%；粳稻谷达到一级的有109个地方品种（上海青、苏州青等），占地方品种总数的21.33%；粳糯稻谷达到一级的有21个地方品种（五石糯、葡萄糯等），占地方品种总数的 4.11%；籼糯稻谷达到一级的只有麻金糯1个地方品种。
依据直链淀粉含量的国家标准，籼稻谷干基含量在17%～22%、粳稻谷干基含量在15%～18%、籼糯稻谷干基含量≤2.0%、粳糯稻谷干基含量≤2.0%为一级。表4中籼稻谷在直链淀粉水平达到一级的有18个地方品种（大稻头、晚籼等），占太湖地区地方品种总数的3.52%；粳稻谷达到一级的有156个地方品种（太湖青、上海青等），占地方品种总数的 30.53%；粳糯稻谷达到一级的有10个地方品种，占地方品种总数的1.96%。
依据糊化温度（碱消值）的国家标准[25]，籼稻谷>4、粳稻谷>6、糯稻谷>6为一级。表3中籼稻谷在糊化温度水平达到一级的有6个地方品种（八十日早、晚杜子籼等），占太湖地区地方品种总数的1.17%；粳稻谷达到一级的有137个地方品种（抱芯太湖青、矮脚太湖青等），占太湖地区地方品种总数的26.81%；糯稻谷一级的有3个地方品种[雪里青糯稻、惯杀糯（煞）、勿糯稻]，占太湖地区地方品种总数的 0.59%。综上所述，太湖地区水稻地方品种中绝大多数粳稻谷在胶稠度、糊化温度或直链淀粉含量水平上能达到一级水平。
3 讨论
针对水稻群体的遗传多样性研究较多，然而这些研究工作所选的分子标记都是随机的，与性状的表现或相应的基因没有发生联系。鉴于此，本研究选用与水稻品质关系密切的淀粉合成基因的内部标记，检测太湖流域水稻地方品种的标记基因型，并结合品质性状的表型，进行遗传多样性分析和评价。选择内部标记的优势，一是标记即代表基因；二是标记可与性状对应，增加研究结果的实用性。
遗传多样性的研究对于作物新品种的选育具有重要意义，提高品种的遗传多样性能够提高品种对外界环境的适应性[26-27]。太湖流域水稻地方品种基因多样性虽然在6个基因位点上（AGPsma、AGPiso、Pull、SSSⅢ-2、SSSⅡ-3、Sbe3）略低于育成品种，但地方品种的平均基因多样性和PIC值均略高于育成品种。其中育成品种是选择了来源广泛的一些品种，比如美国稻、日本稻还有一些国内从南到北的一些品种，而地方品种均是太湖流域的水稻品种。从聚类分析的结果看，整个群体可以被分为6类，其中第Ⅰ类群为目前生产上常用的籼稻地方品种，育成品种粳稻和地方品种粳稻分别集中在不同的区域，已经出现了遗传分化。因此，有必要研究和利用地方品种群体中丰富的品质基因多样性，以拓宽未来选育优质水稻新品种的遗传基础。
本研究所选材料是从近千份太湖地区的地方品种中根据品质性状的差异选择的。这些地方品种在直链淀粉含量、糊化温度和胶稠度等性状上，有67个品种在一个性状上达到一级标准；95个品种在2个性状上达到了一级标准，有4个品种在3个性状上都达到了一级标准。尽管这些老的地方品种资源植株较高、易倒伏，但在淀粉品质性状上仍然具有很好的表现，这些品种可用于今后拓宽淀粉合成基因的遗传基础和品质育种等方面的研究。 参考文献：
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关键词：太湖稻区；基因内分子标记；淀粉合成相关基因；多样性
中图分类号： S511.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0098-06
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随着分子生物学技术的发展，目前已定位了一些与淀粉形成或与稻米品质形成有关的基因，这些基因主要包括颗粒淀粉合成酶基因（Wx）、分支酶基因（Sbe1、Sbe3）、可溶性淀粉合成酶基因（Sss1）、异淀粉酶基因（Isa）和极限糊精酶或R酶基因（Pull）等。吴洪恺等利用Wx基因对RVA谱进行研究，发现RVA的8个特征值的表现均起主要作用，对支链淀粉合成相关基因Sbe1、Sss1均表现明显的上位效应[13]。严长杰等以53个籼粳品种和近年育成的高产水稻品种为材料，设计Wx、Sbe1、Sbe3基因的分子标记，分析3个基因位点的遗传学效应。3个基因位点不同的等位基因对稻米淀粉的合成具有不同的遗传效应，其中Wx基因的影响最重要[14]。陈峰等利用Wx、Sbe1、Sbe3标记分析3个基因对稻米理化品质和RVA谱特征的效应，不同基因型品种间淀粉的理化特性（AC、GC、RVA）存在显著或极显著差异，而3个基因的联合效应在不同基因型组合间也存在显著的差异[15]。
金伟栋等利用微卫星标记（simple sequence repeat，SSR），对129个太湖流域粳稻地方品种资源核心种质进行了DNA分子水平的多态性分析，结果表明，太湖流域粳稻地方品种种质不仅具有丰富的遗传变异，同时保留了大量的稀有等位变异[9]。于萍等采用45对SSR引物对224份太湖流域粳稻地方品种进行遗传多样性分析，得出太湖流域粳稻地方品种SSR多样性较低、稀有类型等位基因较多的结论[16]。罗兵等利用SSR引物对太湖地区的42份粳稻品种进行遗传多样性分析，42份粳稻品种间的遗传相似系数平均为0.610 0，供试材料相似度高，每个多态位点的PIC值平均为0.496 6[17]。Debjani等利用36对SNP标记12条水稻染色体，对印度东北部地区的6 984份水稻品种进行遗传多样性分析，发现多态信息含量（PIC）的变幅为0.004～0.375，基因多样性的变幅为0.006～0.500[18]。Mehrzad等利用地方品种、纯系品种、育成品种和适应于Giulan省气候环境的外国品种为供试材料，采用分布在12对染色体上的52个引物来检测94份水稻基因型的遗传多样性，发现最高的和最低的PIC值分别为0892和0.423[19]。然而这些研究工作，所选的分子标记都是随机的，与性状的表现或相应的基因没有发生联系。因此，本研究选用与水稻品质关系密切的淀粉合成基因的内部标记，检测太湖流域水稻地方品种的标记基因型，并结合品质性状的表型，进行遗传多样性分析和评价。其次，基于各材料间的Nei氏遗传距离，按照UPGMA方法对511份水稻材料和86份水稻育成品种进行聚类，揭示太湖流域水稻地方品种资源的品质基因的遗传差异。研究结果可为保护稻种基因资源的多样性，充分利用优质基因，培育品质更为优良的水稻品种提供参考。
1 材料与方法
在江苏省苏州市农业科学院种植511个太湖地区水稻地方品种，其中粳稻423个、糯稻15个、粳糯39个、籼稻29个、籼糯5个以及86个来源广泛的育成品种（来自日本、美国和中国各地）。其中有个别品种名字相同但来源或者材料本身有差异，所以仍以相同的名字表示，但在相同的名字后面加了1，2……，以示区分。在幼苗期进行了取样和DNA提取，并在实验室进行基因内部标记（表1）的检测，这些标记位点共与19个淀粉合成基因有关。秋季，将这些材料分批收获，开展表观直链淀粉含量、胶稠度和糊化温度等品质性状的测定工作[20-21]。
1.1 标记基因型的检测
采用SDS方法提取DNA，再利用各标记相应的引物在各样本内进行PCR扩增，如果是CAPS分子标记，还需对PCR产物进行相应的酶切。PCR产物或酶切后产物经1%的琼脂糖凝胶或6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离不同大小的DNA片段。电泳条件选择的依据是多态性条带的差异大小，如大于50 bp，则选用琼脂糖凝胶，电泳后EB染色显带；小于 10 bp，则选用聚丙烯酰胺凝胶。电泳结束后用银染方法来显示DNA条带，结果用ScanMaker 3830扫描仪（Microtek，上海，中国）扫描。 1.2 统计分析
每1对引物检测1个位点，每1条多态性带为1个等位基因，对所有供试材料的等位基因进行记录。应用PowerMarker 3.25统计软件[22]进行一般统计量分析，获得等位变异数目、主效等位变异频率、基因多样性以及多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）[23]等参数值。进一步计算得到个体以及亚群间的Nei氏遗传距离矩阵，通过 UPGMA（unweighted pair group method with average）算法进行遗传聚类分析，并使用MEGA 4.0观察聚类图。
2 结果与分析
2.1 与淀粉合成相关基因多样性分析
对地方品种粳稻和育成品种粳稻进行对比分析，结果（表2）表明，地方品种粳稻的基因多样性平均为0.198 8，变幅为0.009 4～0.652 0，多态信息含量平均为0.172 6，变幅为0.009 4～0.588 7，其中（CT）n基因位点的多态性最高，Pull基因位点的多态性最低；而育成品种粳稻基因的多样性平均为0.128 2，变幅为0.000 0～0.511 6，多态信息含量平均为0.110 1，变幅为0.000 0～0.392 9，其中SSSⅢ-2基因位点的多态性最高，Wx、AATT、SSSⅥ-2基因位点的多态性最低。通过综合比较，地方品种粳稻比育成品种粳稻有较高的基因多样性和多态信息含量。
2.2 基于遗传距离聚类
基于各材料间的Nei氏遗传距离，按照UPGMA方法对511份水稻材料和86份水稻育成品种同时进行聚类分析，整个群体可以被分为6类（图1）。从聚类图来看，育成品种粳稻主要集中在第Ⅱ类群和第Ⅲ类群右上半段，地方品种粳稻主要集中在第Ⅲ类群下半段、第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ类群，二者位于不同的区域，已发生明显的遗传分化。第Ⅰ类群主要是籼稻地方品种。从聚类图中也发现，少数育成品种仍然夹杂在地方品种中，在等位基因组合上表现一致。如在树形图中，育成品种扬稻6号、水晶3号与地方品种水晶白稻、西石黄等在遗传距离上靠近；同样，育成品种武粳15与地方品种麻金糯、落霜青、田鸡青等在遗传距离上靠近。相反，少数地方品种也夹杂在育成品種中。如在树形图中，地方品种芦粳青、苏粳5号与育成品种淮稻11号、南粳44在遗传距离上靠近。这些结果表明，太湖地区的水稻种质资源中，少数地方品种与少数育成品种的相似系数较大，遗传差异较小，而大多地方品种资源与育成品种相似系数较小，位于不同的分支或群，遗传差异大。
2.3 品质性状的分类
表3、表4和表5是根据优质稻谷的国家标准[24]对地方品种进行的等级划分，对胶稠度性状，籼稻谷≥70 mm、粳稻谷≥80 mm、籼糯稻谷≥100 mm、粳糯稻谷≥100 mm为一级，从表4可以看出：从籼稻谷在胶稠度水平达到一级的有5个地方品种（桂圆黄、无锡稻等），占太湖地区地方品种总数的0.978%；粳稻谷达到一级的有109个地方品种（上海青、苏州青等），占地方品种总数的21.33%；粳糯稻谷达到一级的有21个地方品种（五石糯、葡萄糯等），占地方品种总数的 4.11%；籼糯稻谷达到一级的只有麻金糯1个地方品种。
依据直链淀粉含量的国家标准，籼稻谷干基含量在17%～22%、粳稻谷干基含量在15%～18%、籼糯稻谷干基含量≤2.0%、粳糯稻谷干基含量≤2.0%为一级。表4中籼稻谷在直链淀粉水平达到一级的有18个地方品种（大稻头、晚籼等），占太湖地区地方品种总数的3.52%；粳稻谷达到一级的有156个地方品种（太湖青、上海青等），占地方品种总数的 30.53%；粳糯稻谷达到一级的有10个地方品种，占地方品种总数的1.96%。
依据糊化温度（碱消值）的国家标准[25]，籼稻谷>4、粳稻谷>6、糯稻谷>6为一级。表3中籼稻谷在糊化温度水平达到一级的有6个地方品种（八十日早、晚杜子籼等），占太湖地区地方品种总数的1.17%；粳稻谷达到一级的有137个地方品种（抱芯太湖青、矮脚太湖青等），占太湖地区地方品种总数的26.81%；糯稻谷一级的有3个地方品种[雪里青糯稻、惯杀糯（煞）、勿糯稻]，占太湖地区地方品种总数的 0.59%。综上所述，太湖地区水稻地方品种中绝大多数粳稻谷在胶稠度、糊化温度或直链淀粉含量水平上能达到一级水平。
3 讨论
针对水稻群体的遗传多样性研究较多，然而这些研究工作所选的分子标记都是随机的，与性状的表现或相应的基因没有发生联系。鉴于此，本研究选用与水稻品质关系密切的淀粉合成基因的内部标记，检测太湖流域水稻地方品种的标记基因型，并结合品质性状的表型，进行遗传多样性分析和评价。选择内部标记的优势，一是标记即代表基因；二是标记可与性状对应，增加研究结果的实用性。
遗传多样性的研究对于作物新品种的选育具有重要意义，提高品种的遗传多样性能够提高品种对外界环境的适应性[26-27]。太湖流域水稻地方品种基因多样性虽然在6个基因位点上（AGPsma、AGPiso、Pull、SSSⅢ-2、SSSⅡ-3、Sbe3）略低于育成品种，但地方品种的平均基因多样性和PIC值均略高于育成品种。其中育成品种是选择了来源广泛的一些品种，比如美国稻、日本稻还有一些国内从南到北的一些品种，而地方品种均是太湖流域的水稻品种。从聚类分析的结果看，整个群体可以被分为6类，其中第Ⅰ类群为目前生产上常用的籼稻地方品种，育成品种粳稻和地方品种粳稻分别集中在不同的区域，已经出现了遗传分化。因此，有必要研究和利用地方品种群体中丰富的品质基因多样性，以拓宽未来选育优质水稻新品种的遗传基础。
本研究所选材料是从近千份太湖地区的地方品种中根据品质性状的差异选择的。这些地方品种在直链淀粉含量、糊化温度和胶稠度等性状上，有67个品种在一个性状上达到一级标准；95个品种在2个性状上达到了一级标准，有4个品种在3个性状上都达到了一级标准。尽管这些老的地方品种资源植株较高、易倒伏，但在淀粉品质性状上仍然具有很好的表现，这些品种可用于今后拓宽淀粉合成基因的遗传基础和品质育种等方面的研究。 参考文献：
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