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摘 要：本实验以绿原酸为指标对金银花提取工艺进行研究。测定方法为色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）（三乙胺调pH值至3.0）；检测波长为327nm；流速1.0mL·min-1。最佳提取工艺为加入8倍量50%乙醇，超声提取35分钟，连续提取2次。本工艺稳定、可行、收率高。
关键词：金银花；提取；工艺
金银花，又名忍冬，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药，用于各种热性病，如身热、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症。《重庆堂随笔》记载：“清络中风火湿热，解温疫秽恶浊邪，息肝胆浮越风阳，治痉厥癫痫诸症。”金银花具有抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、利胆、降血脂降糖、止血、抗氧化等多种药理学活性[1-5]。金银花可用于治疗高脂血症、百日咳、银屑病、副鼻窦炎、小儿肺炎、风湿性心脏病、钧端螺旋体病等。绿原酸（Chlorogenic acid，以下简称CA），是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinicacid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，是金银花主要成分之一。绿原酸具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝作用、抗内毒素等作用。绿原酸抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茴香醚（BHA）和生育酚等。本实验以绿原酸为指标对金银花提取工艺进行研究。
1 仪器与试药
山东鲁创LC-3000液相色谱仪（梯度）（山东鲁创分析仪器有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；实验室用高纯水制备器（北京科誉兴业科技发展有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海五相仪器仪表有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；UV1600紫外可见分光光度计（西安华辰乐天实验室设备有限公司）。綠原酸对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（南京大唐化工有限公司）；甲醇（北京亚太龙兴化工有限公司）；乙醇（济南圣丰工贸有限公司）；磷酸（南京大唐化工有限公司）；三乙胺（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
2.2.1 提取次数
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩；第二次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩；第三次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。第四次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取四次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.1.2 加醇倍数
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加14倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加12倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第三次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第四次加8倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.1.3 提取时间
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取三次，第一次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加10倍50%乙醇，超声提取35分钟，连续四次，第三次加10倍50%乙醇，超声提取45分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.2 正交试验设计
实验结果表明，提取次数、加醇倍数和提取时间对绿原酸收率影响较大。选择提取次数、加醇倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）（三乙胺调pH值至3.0）；检测波长为327nm；流速1.0mL·min-1；柱温：35℃。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏适量，精密量取，置50mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理十分钟，放置至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
3.3 对照品溶液的制备
分别精密称取绿原酸对照品5mg，置250mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml，30μg/ml，35μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，绿原酸铵对照品在5～35μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的绿原酸对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为97.6%，RSD为0.73%。
4 实验结果
选择提取次数、加醇倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法进行试验，得到最佳提取工艺为加入8倍量50%乙醇，超声提取35分钟，连续提取2次。本工艺稳定、可行、收率高；测定方法法简便、准确，可用于金银花膏中绿原酸的含量测定。
参考文献
[1]宫璀璀，郑乃刚，吴景兰，赖泽仁，何培霞.金银花对大鼠体内和体外RBL细胞的抗氧化保护作用及其机制[J].吉林大学学报（医学版），2009（06）.
[2]杨春佳，苏德望，王跃生，张昆，马淑霞，李丽秋，崔刚.金银花对梗阻性黄疸大鼠菌群失调及内毒素血症的调整作用[J].中国微生态学杂志， 2012（08）.
[3]石远苹.连翘和金钱草与金银花提取物或浸膏对几种常见耐药菌的体外作用研究[J].临床合理用药杂志，2012（15）.
[4]宫璀璀，郑玉霞，郑乃刚，曹阳，孟明利，吴景兰.金银花在体内抗氧化作用的实验研究[J].实用医药杂志，2006（05）.
[5]樊宏伟，肖大伟，余黎，朱荃.金银花及其有机酸类化合物的体外抗血小板聚集作用[J].中国医院药学杂志，2006（02）.
关键词：金银花；提取；工艺
金银花，又名忍冬，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药，用于各种热性病，如身热、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症。《重庆堂随笔》记载：“清络中风火湿热，解温疫秽恶浊邪，息肝胆浮越风阳，治痉厥癫痫诸症。”金银花具有抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、利胆、降血脂降糖、止血、抗氧化等多种药理学活性[1-5]。金银花可用于治疗高脂血症、百日咳、银屑病、副鼻窦炎、小儿肺炎、风湿性心脏病、钧端螺旋体病等。绿原酸（Chlorogenic acid，以下简称CA），是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinicacid，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸，是金银花主要成分之一。绿原酸具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝作用、抗内毒素等作用。绿原酸抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茴香醚（BHA）和生育酚等。本实验以绿原酸为指标对金银花提取工艺进行研究。
1 仪器与试药
山东鲁创LC-3000液相色谱仪（梯度）（山东鲁创分析仪器有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；实验室用高纯水制备器（北京科誉兴业科技发展有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海五相仪器仪表有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；UV1600紫外可见分光光度计（西安华辰乐天实验室设备有限公司）。綠原酸对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（南京大唐化工有限公司）；甲醇（北京亚太龙兴化工有限公司）；乙醇（济南圣丰工贸有限公司）；磷酸（南京大唐化工有限公司）；三乙胺（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
2.2.1 提取次数
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩；第二次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩；第三次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。第四次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续提取四次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.1.2 加醇倍数
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加14倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加12倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第三次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第四次加8倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.1.3 提取时间
取原药材，除去杂质，筛去灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取三次，第一次加10倍50%乙醇，超声提取25分钟，连续四次，第二次加10倍50%乙醇，超声提取35分钟，连续四次，第三次加10倍50%乙醇，超声提取45分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中绿原酸含量并计算绿原酸收率。
2.2 正交试验设计
实验结果表明，提取次数、加醇倍数和提取时间对绿原酸收率影响较大。选择提取次数、加醇倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）（三乙胺调pH值至3.0）；检测波长为327nm；流速1.0mL·min-1；柱温：35℃。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏适量，精密量取，置50mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理十分钟，放置至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
3.3 对照品溶液的制备
分别精密称取绿原酸对照品5mg，置250mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml，30μg/ml，35μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，绿原酸铵对照品在5～35μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的绿原酸对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为97.6%，RSD为0.73%。
4 实验结果
选择提取次数、加醇倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法进行试验，得到最佳提取工艺为加入8倍量50%乙醇，超声提取35分钟，连续提取2次。本工艺稳定、可行、收率高；测定方法法简便、准确，可用于金银花膏中绿原酸的含量测定。
参考文献
[1]宫璀璀，郑乃刚，吴景兰，赖泽仁，何培霞.金银花对大鼠体内和体外RBL细胞的抗氧化保护作用及其机制[J].吉林大学学报（医学版），2009（06）.
[2]杨春佳，苏德望，王跃生，张昆，马淑霞，李丽秋，崔刚.金银花对梗阻性黄疸大鼠菌群失调及内毒素血症的调整作用[J].中国微生态学杂志， 2012（08）.
[3]石远苹.连翘和金钱草与金银花提取物或浸膏对几种常见耐药菌的体外作用研究[J].临床合理用药杂志，2012（15）.
[4]宫璀璀，郑玉霞，郑乃刚，曹阳，孟明利，吴景兰.金银花在体内抗氧化作用的实验研究[J].实用医药杂志，2006（05）.
[5]樊宏伟，肖大伟，余黎，朱荃.金银花及其有机酸类化合物的体外抗血小板聚集作用[J].中国医院药学杂志，2006（02）.