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摘 要：从发病死亡的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）体内分离纯化1株细菌，结合形态学、生理生化分析、PCR检测及序列分析，确定该致病菌为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。药敏试验研究了该菌株对常用抗生素的药物敏感性，结果表明，该菌株对抗生素妥布霉素、诺氟沙星、庆大霉素等敏感，临床上选择诺氟沙星治疗，配合消毒措施，短时间内有效地控制了该疫情。
关键词：瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）;嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）;分离鉴定;药敏试验
本研究对患病瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）进行临床诊断，从病鱼肝脏中分离出细菌，进行染色镜检，生理生化分析，PCR检测，药敏试验研究了该菌株对20种抗生素的敏感性，根据试验结果选择药物进行治疗，效果较好，为进一步研究瓦氏雅罗鱼嗜水气单胞菌致病性奠定了基础，也为水产品检疫、鱼病诊断和珍稀鱼类救护等方面提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 患病的瓦氏雅罗鱼采自本中心养殖车间。
1.1.2 主要试剂 细菌培养基、生化鉴定试剂和药敏纸片均购自北京索莱宝科技有限公司;细菌DNA提取试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASY-T1克隆載体及Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离 在超净工作台内，无菌采集患病的瓦氏雅罗鱼肝脏，挑取肝脏内部划线接种于营养琼脂培养基上，28 ℃细菌培养箱内培养，第二天观察记录生长的菌落特征，如颜色、大小和形态等。然后取单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察。
1.2.2 生理生化鉴定 取单菌落于液体培养基培养后，在无菌条件下用接种环穿刺接种于细菌生化鉴定管中，根据说明书对该菌株进行系统的理化特性测定和分析[1]。
1.2.3 PCR检测 参考相关文献，合成PCR方法检测嗜水气单胞菌的特异性引物，对分离的细菌进行检测[2]。引物序列为：PF：5’-ACCTCAACGTCAACCGCAAGAT-3’;PR：5’-GTCTGCGCTTGTCGGTATCCTC-3’，目的片段长度为876 bp。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌的DNA作为模板，以水为阴性对照模板，按PCR试剂盒说明书设计体系进行扩增。将PCR产物进行电泳，观察目的条带大小，回收纯化目的片段，连接pEASY-T1载体，进行鉴定，提取阳性质粒，测序后比对分析。
1.2.4 药敏试验 将培养18 h的该菌菌液涂布在检测平板上，待稍微干燥后在合适区域贴上药敏纸片，室温放置10 min后，倒置于28 ℃的细菌培养箱内培养，18 h后测量每个药物的抑菌圈直径，分别判定各个药物敏感性。
2 结果
2.1 临床症状
瓦氏雅罗鱼病鱼游动缓慢，体表泛白，鱼鳃和鱼鳍溃烂，鳃丝粘连、肿胀，鳍基部充血，剖检可见肝脏点状出血，肠道肿胀，无明显腹水。初步判定为细菌感染引起的烂鳃病。
2.2 细菌形态
营养琼脂培养基上的菌落颜色呈白色半透明状，菌落为圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐的小菌落。细菌革兰氏染色均呈阴性，菌体呈短小杆状（见封三图1）。
2.3 细菌理化特性
统计生化鉴定结果，该菌株生化特性见表1。参照《伯杰细菌鉴定手册》[1]，可初步判断该菌为嗜水气单胞菌。
2.4 PCR扩增结果及目的片段序列分析
以分离细菌的DNA为模板，用嗜水气单胞菌PCR检测特异性引物进行PCR扩增可得到约876 bp的目的片段（图2），阴性对照无条带。将构建的阳性质粒进行测序，将目的片段基因序列用GenBank中的BLAST工具进行序列比对，比对结果表明该目的片段基因序列和基因库中嗜水气单胞菌的相似性最高，前10个均为嗜水气单胞菌，相似性均在99%以上，表明该菌株为嗜水气单胞菌。
2.5 药敏试验结果
选择常见抗菌药物进行的药敏试验结果表明该分离菌株对妥布霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、盐酸环丙沙星、氧氟沙星、丙氟哌酸等抗生素敏感，对磺胺二甲基嘧啶钠、红霉素、林可霉素、硫醚沙星、两性霉素、氨苄西林、新诺明、头孢拉定、麦迪霉素、卡那霉素不敏感（表2）。
2.6 用药及结果
根据上述药敏实验结果，选择诺氟沙星治疗，同时在饲料中加入大蒜素，水中泼洒聚维酮碘消毒，控制了该疫情。
3 讨论
本研究从病死的瓦氏雅罗鱼体内分离到致病菌，根据临床病变、细菌形态和理化特性分析，怀疑该菌为嗜水气单胞菌，PCR检测出嗜水气单胞菌特异性目的条带，该目的片段测序结果表明，该序列和嗜水气单胞菌的相似性最高，综合判定分离菌株为嗜水气单胞菌。在生理生化特性鉴定中，该分离菌对吲哚、氧化酶、过氧化氢酶、甲基红、葡萄糖、木糖、麦芽糖、肌醇、蔗糖、吲哚试验、明胶液化等的生化反应性与锦鲤源A.hydrophila相同。分离菌株PCR目的基因序列经BLAST比对与GenBank登录的相关序列同源性达99%以上，不同动物源A.hydrophila的生化特性可能存在一些差异。
目前，水产养殖中细菌性疾病是最主要的生物源性疾病。防治细菌性疾病的主要手段是使用药物，抗生素类药物在水产养殖中发挥着重要作用，但在使用过程中药物滥用问题也比较突出，主要表现为不注重科学合理养殖，把防病治病的任务主要寄托在抗病药物的大量使用上。久而久之，药物残留及细菌耐药问题日益严重，逐步成为了引起公众持续关注的公共卫生问题。因此在养殖过程中抗生素的选择和使用必须要注重科学性、合理性，长期不合理的大量使用单一药物可诱导病原菌产生耐药性，动物体内也会累积大量药残，危害消费者健康，还会导致产品禁售，因此平时的养殖要提升养殖条件，提高养殖能力，做好预防措施，预防为主，在选择药物防治前需要做好药敏试验，科学合理用药。本研究药敏结果显示两菌株对盐酸多西环素、烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星等抗生素敏感，和之前研究也基本相符，选择诺氟沙星配合大蒜素等中草药治疗，同时采用聚维酮碘对池水消毒，收到良好效果。本试验为嗜水单胞菌感染的诊断和临床用药提供了参考，而且对鱼类细菌性疾病防治以及公共卫生等研究具有重要意义。
参考文献：
[1] 布坎南，吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.科学出版社，1984：475-487.
[2] 饶静静，李寿崧，黄克和，等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立[J].中国水产科学，2007，14（5）：749-755.
（收稿日期：2020-10-28）
关键词：瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）;嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）;分离鉴定;药敏试验
本研究对患病瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）进行临床诊断，从病鱼肝脏中分离出细菌，进行染色镜检，生理生化分析，PCR检测，药敏试验研究了该菌株对20种抗生素的敏感性，根据试验结果选择药物进行治疗，效果较好，为进一步研究瓦氏雅罗鱼嗜水气单胞菌致病性奠定了基础，也为水产品检疫、鱼病诊断和珍稀鱼类救护等方面提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 患病的瓦氏雅罗鱼采自本中心养殖车间。
1.1.2 主要试剂 细菌培养基、生化鉴定试剂和药敏纸片均购自北京索莱宝科技有限公司;细菌DNA提取试剂盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASY-T1克隆載体及Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离 在超净工作台内，无菌采集患病的瓦氏雅罗鱼肝脏，挑取肝脏内部划线接种于营养琼脂培养基上，28 ℃细菌培养箱内培养，第二天观察记录生长的菌落特征，如颜色、大小和形态等。然后取单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察。
1.2.2 生理生化鉴定 取单菌落于液体培养基培养后，在无菌条件下用接种环穿刺接种于细菌生化鉴定管中，根据说明书对该菌株进行系统的理化特性测定和分析[1]。
1.2.3 PCR检测 参考相关文献，合成PCR方法检测嗜水气单胞菌的特异性引物，对分离的细菌进行检测[2]。引物序列为：PF：5’-ACCTCAACGTCAACCGCAAGAT-3’;PR：5’-GTCTGCGCTTGTCGGTATCCTC-3’，目的片段长度为876 bp。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌的DNA作为模板，以水为阴性对照模板，按PCR试剂盒说明书设计体系进行扩增。将PCR产物进行电泳，观察目的条带大小，回收纯化目的片段，连接pEASY-T1载体，进行鉴定，提取阳性质粒，测序后比对分析。
1.2.4 药敏试验 将培养18 h的该菌菌液涂布在检测平板上，待稍微干燥后在合适区域贴上药敏纸片，室温放置10 min后，倒置于28 ℃的细菌培养箱内培养，18 h后测量每个药物的抑菌圈直径，分别判定各个药物敏感性。
2 结果
2.1 临床症状
瓦氏雅罗鱼病鱼游动缓慢，体表泛白，鱼鳃和鱼鳍溃烂，鳃丝粘连、肿胀，鳍基部充血，剖检可见肝脏点状出血，肠道肿胀，无明显腹水。初步判定为细菌感染引起的烂鳃病。
2.2 细菌形态
营养琼脂培养基上的菌落颜色呈白色半透明状，菌落为圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐的小菌落。细菌革兰氏染色均呈阴性，菌体呈短小杆状（见封三图1）。
2.3 细菌理化特性
统计生化鉴定结果，该菌株生化特性见表1。参照《伯杰细菌鉴定手册》[1]，可初步判断该菌为嗜水气单胞菌。
2.4 PCR扩增结果及目的片段序列分析
以分离细菌的DNA为模板，用嗜水气单胞菌PCR检测特异性引物进行PCR扩增可得到约876 bp的目的片段（图2），阴性对照无条带。将构建的阳性质粒进行测序，将目的片段基因序列用GenBank中的BLAST工具进行序列比对，比对结果表明该目的片段基因序列和基因库中嗜水气单胞菌的相似性最高，前10个均为嗜水气单胞菌，相似性均在99%以上，表明该菌株为嗜水气单胞菌。
2.5 药敏试验结果
选择常见抗菌药物进行的药敏试验结果表明该分离菌株对妥布霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、盐酸环丙沙星、氧氟沙星、丙氟哌酸等抗生素敏感，对磺胺二甲基嘧啶钠、红霉素、林可霉素、硫醚沙星、两性霉素、氨苄西林、新诺明、头孢拉定、麦迪霉素、卡那霉素不敏感（表2）。
2.6 用药及结果
根据上述药敏实验结果，选择诺氟沙星治疗，同时在饲料中加入大蒜素，水中泼洒聚维酮碘消毒，控制了该疫情。
3 讨论
本研究从病死的瓦氏雅罗鱼体内分离到致病菌，根据临床病变、细菌形态和理化特性分析，怀疑该菌为嗜水气单胞菌，PCR检测出嗜水气单胞菌特异性目的条带，该目的片段测序结果表明，该序列和嗜水气单胞菌的相似性最高，综合判定分离菌株为嗜水气单胞菌。在生理生化特性鉴定中，该分离菌对吲哚、氧化酶、过氧化氢酶、甲基红、葡萄糖、木糖、麦芽糖、肌醇、蔗糖、吲哚试验、明胶液化等的生化反应性与锦鲤源A.hydrophila相同。分离菌株PCR目的基因序列经BLAST比对与GenBank登录的相关序列同源性达99%以上，不同动物源A.hydrophila的生化特性可能存在一些差异。
目前，水产养殖中细菌性疾病是最主要的生物源性疾病。防治细菌性疾病的主要手段是使用药物，抗生素类药物在水产养殖中发挥着重要作用，但在使用过程中药物滥用问题也比较突出，主要表现为不注重科学合理养殖，把防病治病的任务主要寄托在抗病药物的大量使用上。久而久之，药物残留及细菌耐药问题日益严重，逐步成为了引起公众持续关注的公共卫生问题。因此在养殖过程中抗生素的选择和使用必须要注重科学性、合理性，长期不合理的大量使用单一药物可诱导病原菌产生耐药性，动物体内也会累积大量药残，危害消费者健康，还会导致产品禁售，因此平时的养殖要提升养殖条件，提高养殖能力，做好预防措施，预防为主，在选择药物防治前需要做好药敏试验，科学合理用药。本研究药敏结果显示两菌株对盐酸多西环素、烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星等抗生素敏感，和之前研究也基本相符，选择诺氟沙星配合大蒜素等中草药治疗，同时采用聚维酮碘对池水消毒，收到良好效果。本试验为嗜水单胞菌感染的诊断和临床用药提供了参考，而且对鱼类细菌性疾病防治以及公共卫生等研究具有重要意义。
参考文献：
[1] 布坎南，吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.科学出版社，1984：475-487.
[2] 饶静静，李寿崧，黄克和，等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立[J].中国水产科学，2007，14（5）：749-755.
（收稿日期：2020-10-28）