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摘要 为了探究微生物处理对梗丝品质的影响，利用1株酵母菌对梗丝进行了处理。在添加量为1%、反应温度为28 ℃、物料含水率控制在45%时，对过程中不同时间段的梗丝常规化学成分、致香成分进行了测定与分析，并对梗絲进行感官质量评价。结果表明：通过微生物对梗丝的作用，梗丝内总糖、还原糖含量随时间的延长呈线性关系降低，其他化学常规成分含量基本稳定不变。致香成分总量在处理18 h时达到最大值，较对照增加35.45%;在处理24 h时，感官质量评价最佳，主要表现在香气量提升，余味改善，致香成分总量较对照增加了9.10%。
关键词 酵母菌;梗丝;香气品质;化学成分;致香成分;感官品质
中图分类号 TS41+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0178-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.047
Abstract In order to investigate the effects of microbiological treatment on tobacco stem-silk， one strain of yeast was used. While the yeast addition amount was 1%， the moisture content was 45%， and the reaction temperature was 28 ℃， chemical components and aroma components were determined at different periods， and the sensory quality was evaluated. The results showed that the content of total sugar and reducing sugar had a downward trend and the content of other material was basically stable with the extension of processing time. The total aroma constituents of tobacco stem-silk reached a maximum at 18 h， increasing 35.98% than the untreated. At 24 h， the tobacco stem-silk had a best sensory quality， which was mainly reflected in the increase of aroma and aftertaste. The total aroma constituents of tobacco stem-silk increased 9.27% than the untreated.
Key words Yeast;Stem-silk;Aroma quality;Chemical composition;Aroma component;Sensory quality
随着我国烟草行业的发展，原料的日益紧缺以及降焦减害、降本增效的持续开展，烟梗制品将在卷烟叶组配方中占有更重要的地位。在配方中加入梗丝后，减少了烟丝用量，降低了卷烟成本，但由于烟梗中绝大多数香味致香成分含量都低于相应的叶片[1-3]，细胞壁物质含量较高，热裂解产物具有较强的刺激性和杂气、香气淡薄，带有一定的灼热感[4-5]，限制了其在卷烟中的应用，因而如何提高梗丝的品质是当前急需解决的问题。
微生物在烟草陈化发酵改善品质过程中起着至关重要的作用，通过直接或间接利用某些木质素、纤维素、蛋白质和微量元素等营养源，分解代谢合成出不同种类的生物酶，促进致香成分产生和积累并降低有害成分的含量[6-7]。陈兴等[8]利用从醇化烤烟烟叶表面分离得到的微生物菌株V35制成菌剂处理梗丝改善品质，提升梗丝香气量，降低杂气和刺激性。巩效伟等[9]利用产香微生物处理梗丝，香气成分的含量有所增加，提升梗丝品质。酵母菌是微生物中重要的一种，可产生风味物质，增香效果显著、安全性较强。现已有将酵母菌应用于烟草中的相关研究。Koller[10]在雪茄烟叶发酵过程中添加酵母菌，有效缩短了发酵时间;郭林青等[11]利用从水果表面筛选出的汉逊酵母菌对烟末进行发酵改善其特征香味;郑坚强等[12]利用西方许旺酵母发酵处理后的烟叶香气质和香气量均有所增加，感官质量明显改善;戴丽君等[13]利用酵母处理烟梗萃取浓缩液，提高造纸法再造烟叶整体吃味质量;周瑢等[14]利用生香酵母发酵处理烟梗提取液发酵48 h，总香气成分增加了172.13%;张晨等[15]利用酿酒酵母改进烟草萃取液的香气特性。但目前将酵母菌应用于梗丝上的研究鲜见报道。因此，该研究主要将酵母菌应用于梗丝上，探讨处理过程中香气品质的变化，以期提高梗丝的可用性，增加在叶组配方中用量，旨在为烟梗制品在卷烟工业中更好的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
新型梗丝样品（2010年、云南烤烟长梗K326，经微波膨胀、回潮、切片、切丝、干燥等工序制备而成）;酵母菌（国内某品牌）;KBF-240型恒温恒湿箱（Binder公司，德国）;BT224S型电子秤（0.000 1 g，Sartorus公司，德国）;YD2430填充值测定仪（郑州嘉德机电科技有限公司）;GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;6890N/5973N气相/质谱联用仪（美国Agilent公司）;AA3连续流动化学分析仪（德国，布朗-卢比公司）。
1.2 方法
1.2.1 梗丝处理。 称取5 kg的新型梗丝样品，以质量分数1.0%的酵母用超纯水溶解，用喷雾器将处理液均匀喷洒加至梗丝上，含水率控制在45%左右，将梗丝装入密封袋，并在袋上扎少量小孔，放入恒温恒湿箱中培养，培养温度设置为28 ℃。每次均从外向里取样100 g，每间隔6 h取样一次，时间梯度设置分别为6、12、18、24和30 h，对照选用喷洒超纯水控制最终含水率为45%左右的样品。取出的样品及对照样需放入温度设置为120 ℃烘箱中杀菌、烘干，最终含水率控制在11%～13%。设置3个重复。
1.2.2 化学成分的测定。
按烟草行业标准方法（YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 161—2002、YC/T 162—2002、YC/T 217—2007）测定样品中总糖、还原糖、总烟碱、总氮、氯、钾的含量。
1.2.3 致香成分的测定。
将样品磨碎，过60目筛，于温度22 ℃和相对湿度60%平衡24 h，准确称取平衡后的粉末样品26.0 g，置入同时蒸馏萃取装置中，并加入固定量的内标化合物，采用二氯甲烷作为溶剂对样品粉末进行连续动态萃取2 h，所得提取物经无水硫酸钠干燥后浓缩定容至1.0 mL。浓缩液采用Agilent 6890N/5975气相/质谱联用分析仪进行分析，所得图谱经计算机谱库（NIST05，Wiley275）检索，按照文献[16]的方法计算各峰的相对含量。
GC/MS的分析条件：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管柱;进样口温度240 ℃;载气为He，1 mL/min;程序升温：50 ℃（1 min）8 ℃/min 160 ℃（2 min）8 ℃/min 260 ℃（15 min）;进样量0.5 μL;分流比为25∶1;传输线温度280 ℃;电离方式为EI;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;4级杆温度160 ℃;质量范围35～455 amu。
1.2.4 样品感官质量评价。
将对照梗丝样品和经菌剂处理不同时间的梗丝，放入温度（22±1）℃、相对湿度（60±2）% 平衡48 h后，按8%的比例进行掺兑试验，手工卷制成卷烟后，按照GB 5606.4—2005规定的方法，由7位评吸专家组成的评吸小组进行感官质量的评定。
1.3 数据分析
采用EXCEL和SPSS软件进行数据分析，并用Tukey法進行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 酵母菌处理梗丝过程中化学成分的变化
按质量分数1%的添加量对梗丝处理后，对过程中常规化学成分含量变化进行检验分析，结果发现（表1），经菌剂处理后，总糖、还原糖含量随着处理时间的延长呈线性关系下降，决定系数R2分别为0.97、0.94。整个过程中，梗丝中氯离子、钾离子、烟碱含量变化不显著。在处理12 h后，总糖含量开始发生显著变化，在处理18 h后，总糖、还原糖含量开始发生极显著变化，两糖差达到显著水平，梗丝的糖氮比和糖碱比均达到极显著。对比对照，总糖、还原糖含量在处理18 h时，分别下降了12.30%、7.50%;在处理24 h时，分别下降了17.69%、13.20%。
2.2 酵母菌处理梗丝过程中致香成分的变化
利用GC-MS方法对样品梗丝中的致香成分进行检测，结果发现（表2），在菌剂的处理下，各类物质的总量呈动态变化，按照功能团将致香成分分为酮类、醛类、醇类、酯类、酸类、烯烃类、酚类、杂环类8类物质，进行分类比较发现，酮类、醛类、醇类、酯类、酸类、烯烃类物质在反应前6 h含量降低，随后逐渐增高，达到最大值后，迅速降低。其中酮类物质、醛类物质、醇类物质、酸类物质总量均在18 h达到最大值;此时，对比对照，酮类物质总量增加2.98%，主要表现在3-羟基-2-丁酮、茄酮、β-二氢大马酮、巨豆三烯酮 A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮C、香叶基丙酮含量增加;醛类物质总量虽然有所降低，但苯甲醛、糠醛含量有所增加;醇类物质总量增加24.97%，主要表现在苯乙醇、植醇、西柏三烯二醇含量增加;酸类物质总量增加62.68%，主要表现在2-甲基丁酸、棕榈酸、肉豆蔻酸有所增加。其中，棕榈酸含量在整个处理过程中先降低后大幅度增加，在18 h时达到最大值，之后有所降低，相应的酯类物质有所提升。2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、吲哚、2，3′-联吡啶含量亦有所增加。致香物质总量在18 h时达到最大值，较对照增加35.45%，除棕榈酸外致香物质总量增加12.84%。新植二烯在24 h时达到最大值，较对照增量可达到19.27%，此时致香物质总量增加9.10%，除棕榈酸外致香物质总量增加9.07%。说明利用酵母菌处理有利于促进梗丝中香气前体物质的合成、降解，香气成分的形成、转化，梗丝中香气物质的含量增加。
2.3 酵母菌处理梗丝对感官质量的影响
从表3可以看出，菌剂处理24 h掺兑后的样品感官质量最好，18、24 h的均优于对照，主要表现在烟香丰富，香气质细腻，协调好，杂气降低，刺激性减小，余味较干净。说明经酵母菌处理适宜的时间有利于提高掺配样的感官质量，24 h优于18 h，主要表现在香气量显著提升，余味明显改善。
3 讨论
国内外对烟叶最佳的糖碱比看法不一，一般认为云南烟叶以10～12∶1为好，能够体现云烟的香型特点[17]。香气物质是影响卷烟香吃味质量的重要因素。烟草发酵过程中，氧化作用、微生物作用和酶作用相辅相承，对烟草内在化学物质产生综合效应，使不具有香气特征的大分子化合物发生氧化分解，而使具有香气特征的小分子化合物如挥发酸、羰基化合物以及各种芳香类物质等得以合成，从而使卷烟的吸食品质明显提升[18-19]。新植二烯是烟叶中性挥发成分最为丰富的成分，既是叶绿素的降解产物又是低分子质量香气成分的前体物质，能够增进烟的吃味和香味，具有清香气且刺激较小的特点。在烟叶燃烧时可直接进入烟气，具有降低刺激、醇和烟气的作用。高级脂肪酸可以调节烟气的酸碱度，使得烟气醇和，增加烟气浓度，间接影响烟气的香气[17]。 该研究结果中，在酵母菌处理过程中，总糖、还原糖含量随时间的延长呈线性关系逐渐降低，其他物质含量则基本稳定不变，糖碱比及两糖差减小，更接近优质烟丝。在处理前期梗丝的致香成分都有一定的降低，可能是在发酵前期内部温度较高，香气物质散失[20]，而分解产生香气物质的速率低于散失速率。反应时间是影响微生物处理效果的重要因素。酵母菌处理梗丝12 h后感官质量提升，其原因可能主要是由于微生物处理后能够产生更多的烟草致香物质，进而提高其在卷烟产品中的感官质量[21]。处理24 h的样品优于18 h的，主要表现在香气量上有所提升，余味舒适;原因可能是在18 h时，棕榈酸含量过高，降低了香气量，不利于梗丝的品质，在24 h时，棕榈酸含量又有所降低，提升了梗丝的香味品质，这与史宏志等[17]在烤烟烟叶高级脂肪含量与评分分值的相关分析的研究结果相一致。
4 结论
在酵母菌添加量为1%、水分含量为45%、反应温度为28 ℃时，总糖、还原糖含量随时间的延长呈线性关系逐渐降低，其他物质含量则基本稳定不变。在处理18 h时，致香成分总量达到最大值，较对照增加35.45%;在处理24 h时，梗丝的感官质量评价最佳，烟气协调，烟香丰富，余味明显改善，此时致香成分总量较对照增加了9.10%。采用酵母菌处理梗丝有利于提升梗丝的品质，对后期放大试验应用生产有一定的指导作用。
参考文献
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[19] 郭晓雪，金保锋，沈光林.烟叶发酵研究进展[J].烟草科技，2004，37（11）：7-9，14.
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[21] 胡建军，周冀衡，李文伟，等.烤烟香味成分与其感官质量的典型相关分析[J].烟草科技，2007，40（3）：9-15，22.
关键词 酵母菌;梗丝;香气品质;化学成分;致香成分;感官品质
中图分类号 TS41+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0178-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.047
Abstract In order to investigate the effects of microbiological treatment on tobacco stem-silk， one strain of yeast was used. While the yeast addition amount was 1%， the moisture content was 45%， and the reaction temperature was 28 ℃， chemical components and aroma components were determined at different periods， and the sensory quality was evaluated. The results showed that the content of total sugar and reducing sugar had a downward trend and the content of other material was basically stable with the extension of processing time. The total aroma constituents of tobacco stem-silk reached a maximum at 18 h， increasing 35.98% than the untreated. At 24 h， the tobacco stem-silk had a best sensory quality， which was mainly reflected in the increase of aroma and aftertaste. The total aroma constituents of tobacco stem-silk increased 9.27% than the untreated.
Key words Yeast;Stem-silk;Aroma quality;Chemical composition;Aroma component;Sensory quality
随着我国烟草行业的发展，原料的日益紧缺以及降焦减害、降本增效的持续开展，烟梗制品将在卷烟叶组配方中占有更重要的地位。在配方中加入梗丝后，减少了烟丝用量，降低了卷烟成本，但由于烟梗中绝大多数香味致香成分含量都低于相应的叶片[1-3]，细胞壁物质含量较高，热裂解产物具有较强的刺激性和杂气、香气淡薄，带有一定的灼热感[4-5]，限制了其在卷烟中的应用，因而如何提高梗丝的品质是当前急需解决的问题。
微生物在烟草陈化发酵改善品质过程中起着至关重要的作用，通过直接或间接利用某些木质素、纤维素、蛋白质和微量元素等营养源，分解代谢合成出不同种类的生物酶，促进致香成分产生和积累并降低有害成分的含量[6-7]。陈兴等[8]利用从醇化烤烟烟叶表面分离得到的微生物菌株V35制成菌剂处理梗丝改善品质，提升梗丝香气量，降低杂气和刺激性。巩效伟等[9]利用产香微生物处理梗丝，香气成分的含量有所增加，提升梗丝品质。酵母菌是微生物中重要的一种，可产生风味物质，增香效果显著、安全性较强。现已有将酵母菌应用于烟草中的相关研究。Koller[10]在雪茄烟叶发酵过程中添加酵母菌，有效缩短了发酵时间;郭林青等[11]利用从水果表面筛选出的汉逊酵母菌对烟末进行发酵改善其特征香味;郑坚强等[12]利用西方许旺酵母发酵处理后的烟叶香气质和香气量均有所增加，感官质量明显改善;戴丽君等[13]利用酵母处理烟梗萃取浓缩液，提高造纸法再造烟叶整体吃味质量;周瑢等[14]利用生香酵母发酵处理烟梗提取液发酵48 h，总香气成分增加了172.13%;张晨等[15]利用酿酒酵母改进烟草萃取液的香气特性。但目前将酵母菌应用于梗丝上的研究鲜见报道。因此，该研究主要将酵母菌应用于梗丝上，探讨处理过程中香气品质的变化，以期提高梗丝的可用性，增加在叶组配方中用量，旨在为烟梗制品在卷烟工业中更好的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
新型梗丝样品（2010年、云南烤烟长梗K326，经微波膨胀、回潮、切片、切丝、干燥等工序制备而成）;酵母菌（国内某品牌）;KBF-240型恒温恒湿箱（Binder公司，德国）;BT224S型电子秤（0.000 1 g，Sartorus公司，德国）;YD2430填充值测定仪（郑州嘉德机电科技有限公司）;GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;6890N/5973N气相/质谱联用仪（美国Agilent公司）;AA3连续流动化学分析仪（德国，布朗-卢比公司）。
1.2 方法
1.2.1 梗丝处理。 称取5 kg的新型梗丝样品，以质量分数1.0%的酵母用超纯水溶解，用喷雾器将处理液均匀喷洒加至梗丝上，含水率控制在45%左右，将梗丝装入密封袋，并在袋上扎少量小孔，放入恒温恒湿箱中培养，培养温度设置为28 ℃。每次均从外向里取样100 g，每间隔6 h取样一次，时间梯度设置分别为6、12、18、24和30 h，对照选用喷洒超纯水控制最终含水率为45%左右的样品。取出的样品及对照样需放入温度设置为120 ℃烘箱中杀菌、烘干，最终含水率控制在11%～13%。设置3个重复。
1.2.2 化学成分的测定。
按烟草行业标准方法（YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 161—2002、YC/T 162—2002、YC/T 217—2007）测定样品中总糖、还原糖、总烟碱、总氮、氯、钾的含量。
1.2.3 致香成分的测定。
将样品磨碎，过60目筛，于温度22 ℃和相对湿度60%平衡24 h，准确称取平衡后的粉末样品26.0 g，置入同时蒸馏萃取装置中，并加入固定量的内标化合物，采用二氯甲烷作为溶剂对样品粉末进行连续动态萃取2 h，所得提取物经无水硫酸钠干燥后浓缩定容至1.0 mL。浓缩液采用Agilent 6890N/5975气相/质谱联用分析仪进行分析，所得图谱经计算机谱库（NIST05，Wiley275）检索，按照文献[16]的方法计算各峰的相对含量。
GC/MS的分析条件：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管柱;进样口温度240 ℃;载气为He，1 mL/min;程序升温：50 ℃（1 min）8 ℃/min 160 ℃（2 min）8 ℃/min 260 ℃（15 min）;进样量0.5 μL;分流比为25∶1;传输线温度280 ℃;电离方式为EI;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;4级杆温度160 ℃;质量范围35～455 amu。
1.2.4 样品感官质量评价。
将对照梗丝样品和经菌剂处理不同时间的梗丝，放入温度（22±1）℃、相对湿度（60±2）% 平衡48 h后，按8%的比例进行掺兑试验，手工卷制成卷烟后，按照GB 5606.4—2005规定的方法，由7位评吸专家组成的评吸小组进行感官质量的评定。
1.3 数据分析
采用EXCEL和SPSS软件进行数据分析，并用Tukey法進行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 酵母菌处理梗丝过程中化学成分的变化
按质量分数1%的添加量对梗丝处理后，对过程中常规化学成分含量变化进行检验分析，结果发现（表1），经菌剂处理后，总糖、还原糖含量随着处理时间的延长呈线性关系下降，决定系数R2分别为0.97、0.94。整个过程中，梗丝中氯离子、钾离子、烟碱含量变化不显著。在处理12 h后，总糖含量开始发生显著变化，在处理18 h后，总糖、还原糖含量开始发生极显著变化，两糖差达到显著水平，梗丝的糖氮比和糖碱比均达到极显著。对比对照，总糖、还原糖含量在处理18 h时，分别下降了12.30%、7.50%;在处理24 h时，分别下降了17.69%、13.20%。
2.2 酵母菌处理梗丝过程中致香成分的变化
利用GC-MS方法对样品梗丝中的致香成分进行检测，结果发现（表2），在菌剂的处理下，各类物质的总量呈动态变化，按照功能团将致香成分分为酮类、醛类、醇类、酯类、酸类、烯烃类、酚类、杂环类8类物质，进行分类比较发现，酮类、醛类、醇类、酯类、酸类、烯烃类物质在反应前6 h含量降低，随后逐渐增高，达到最大值后，迅速降低。其中酮类物质、醛类物质、醇类物质、酸类物质总量均在18 h达到最大值;此时，对比对照，酮类物质总量增加2.98%，主要表现在3-羟基-2-丁酮、茄酮、β-二氢大马酮、巨豆三烯酮 A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮C、香叶基丙酮含量增加;醛类物质总量虽然有所降低，但苯甲醛、糠醛含量有所增加;醇类物质总量增加24.97%，主要表现在苯乙醇、植醇、西柏三烯二醇含量增加;酸类物质总量增加62.68%，主要表现在2-甲基丁酸、棕榈酸、肉豆蔻酸有所增加。其中，棕榈酸含量在整个处理过程中先降低后大幅度增加，在18 h时达到最大值，之后有所降低，相应的酯类物质有所提升。2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、吲哚、2，3′-联吡啶含量亦有所增加。致香物质总量在18 h时达到最大值，较对照增加35.45%，除棕榈酸外致香物质总量增加12.84%。新植二烯在24 h时达到最大值，较对照增量可达到19.27%，此时致香物质总量增加9.10%，除棕榈酸外致香物质总量增加9.07%。说明利用酵母菌处理有利于促进梗丝中香气前体物质的合成、降解，香气成分的形成、转化，梗丝中香气物质的含量增加。
2.3 酵母菌处理梗丝对感官质量的影响
从表3可以看出，菌剂处理24 h掺兑后的样品感官质量最好，18、24 h的均优于对照，主要表现在烟香丰富，香气质细腻，协调好，杂气降低，刺激性减小，余味较干净。说明经酵母菌处理适宜的时间有利于提高掺配样的感官质量，24 h优于18 h，主要表现在香气量显著提升，余味明显改善。
3 讨论
国内外对烟叶最佳的糖碱比看法不一，一般认为云南烟叶以10～12∶1为好，能够体现云烟的香型特点[17]。香气物质是影响卷烟香吃味质量的重要因素。烟草发酵过程中，氧化作用、微生物作用和酶作用相辅相承，对烟草内在化学物质产生综合效应，使不具有香气特征的大分子化合物发生氧化分解，而使具有香气特征的小分子化合物如挥发酸、羰基化合物以及各种芳香类物质等得以合成，从而使卷烟的吸食品质明显提升[18-19]。新植二烯是烟叶中性挥发成分最为丰富的成分，既是叶绿素的降解产物又是低分子质量香气成分的前体物质，能够增进烟的吃味和香味，具有清香气且刺激较小的特点。在烟叶燃烧时可直接进入烟气，具有降低刺激、醇和烟气的作用。高级脂肪酸可以调节烟气的酸碱度，使得烟气醇和，增加烟气浓度，间接影响烟气的香气[17]。 该研究结果中，在酵母菌处理过程中，总糖、还原糖含量随时间的延长呈线性关系逐渐降低，其他物质含量则基本稳定不变，糖碱比及两糖差减小，更接近优质烟丝。在处理前期梗丝的致香成分都有一定的降低，可能是在发酵前期内部温度较高，香气物质散失[20]，而分解产生香气物质的速率低于散失速率。反应时间是影响微生物处理效果的重要因素。酵母菌处理梗丝12 h后感官质量提升，其原因可能主要是由于微生物处理后能够产生更多的烟草致香物质，进而提高其在卷烟产品中的感官质量[21]。处理24 h的样品优于18 h的，主要表现在香气量上有所提升，余味舒适;原因可能是在18 h时，棕榈酸含量过高，降低了香气量，不利于梗丝的品质，在24 h时，棕榈酸含量又有所降低，提升了梗丝的香味品质，这与史宏志等[17]在烤烟烟叶高级脂肪含量与评分分值的相关分析的研究结果相一致。
4 结论
在酵母菌添加量为1%、水分含量为45%、反应温度为28 ℃时，总糖、还原糖含量随时间的延长呈线性关系逐渐降低，其他物质含量则基本稳定不变。在处理18 h时，致香成分总量达到最大值，较对照增加35.45%;在处理24 h时，梗丝的感官质量评价最佳，烟气协调，烟香丰富，余味明显改善，此时致香成分总量较对照增加了9.10%。采用酵母菌处理梗丝有利于提升梗丝的品质，对后期放大试验应用生产有一定的指导作用。
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