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随着社会的发展和人们对食品要求的提高，食品安全问题被提到越来越重要的位置，食品安全检测的方法也在不断地更新迭代。食品被细菌污染的程度可用来判定食品的卫生质量，针对食品中的微小颗粒以及颜色特殊的产品做菌落总数计数时，无论是我国的国家标准还是ISO标准都存在相同的问题，比如食品中的微小颗粒与菌落相似、样品本身的颜色原因导致菌落难以观察，从而影响试验过程中菌落总数的观察和计数，使检测结果产生误差。
参照《化妆品安全技术规范》（2015年版）第五章微生物检验方法中菌落总数检验方法的描述内容，为了便于區别化妆品中的颗粒与菌落，可在培养基中加入TTC（红四氮唑，又叫2，3，5-三苯基氯化四氮唑）溶液，利用TTC在菌落生长过程中产生的琥珀脱氢酶使无色的TTC还原成红色的TPF原理，使菌落更容易观察和计数。但对于TTC的浓度，各类文献给出的结果不完全一致，本文选择自然界中比较常见的革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌-大肠埃希氏菌以及芽孢菌-枯草芽孢杆菌作为试验菌种，以麦片和乳粉为样品基质，对TTC的浓度进行确认，确定最佳使用浓度，对食品中菌落总数的检测方法进行优化，从而提高检测结果的准确性。
一、材料
平板计数琼脂，北京陆桥；营养肉汤，北京路桥；培养皿，瑾博；TTC，麦克林；大肠埃希氏菌，ATCC 8739；金黄色葡萄球菌，ATCC 6538；枯草芽孢杆菌，ATCC 9372；生物安全柜，1384；恒温培养箱，DHP-9162；电子天平，MP3KC；移液器，GP00180。
二、方法
1.菌种的制备。各取1环工作菌种接种至9mL的营养肉汤中，在36℃条件下培养18-24小时，此时的菌种浓度约为1.0×109CFU/mL。使用无菌生理盐水对菌液进行稀释，根据常用的食品安全标准，食品中的大部分限量值为103-105CFU/g，因此将菌液浓度稀释至105CFU/mL、106CFU/mL备用。
2.不同浓度TTC平板计数琼脂制备。配制平板计数琼脂，经121℃灭菌15分钟后置于60℃的水浴中，将TTC用无菌水配制成5%的浓度，过滤除菌后备用。以无菌操作添加到平板计数琼脂中，使得平板计数琼脂中TTC的浓度分别为0.08%、0.06%、0.04%、0.02%、0.01%、0.008%、0.004%、0.002%、0.001%、0.0008%、0.0004%、0.0002%、0.0001%，制备好后放在48℃的水浴中备用。
3.操作步骤。取制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌1mL至培养皿中，每个浓度TTC的培养基准备2个培养皿，加入含不同浓度TTC的PCA培养基和2个不含TTC的培养基作为对照组。培养基凝固后反转培养皿，在36℃条件下培养48小时。金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌在含不同浓度TTC培养基中的菌落计数及菌落颜色如表1所示。
由表1可知，当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0020%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的金黄色葡萄球菌的菌落数相比无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对金黄色葡萄球菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0020%。当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0080%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的大肠埃希氏菌的菌落数无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对大肠埃希氏菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0080%。当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0080%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的枯草芽孢杆菌的菌落数无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对枯草芽孢杆菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0080%。结合三种菌种的试验结果，食品中TTC的浓度在0.0010%- 0.0020%之间较为适宜。
4.在具体产品中的验证方法。设计麦片和牛奶两类产品样品，为了结果便于统计，将牛奶和麦片进行高压灭菌冷却后，称取25g的麦片和25mL的牛奶于均质袋中，每个样品称取3个平行。将制备好的菌液分别各取1份混合，使得混合后的菌液浓度约为105CFU/mL，每个样品的加菌量为1mL，使得样品的最终浓度为103CFU/g，加入225mL的稀释液后得到10-1稀释液，按照梯度稀释到10-2、10-3稀释液。每个稀释度取各取1mL至4个无菌培养皿中，2个培养皿中加入15-20mL含0.0015%TTC的PCA培养基，另外2个培养皿中加入不含TTC的PCA培养基。用25mL的无菌稀释液代替样品作为对照组，加入不含TTC的PCA培养基。待上述培养基冷却凝固后，反转培养皿并在36℃条件下培养48小时，然后取出计数，计算平均结果如表2。
从表2可以看出，当采用含0.0015%TTC的PCA时，样品中的菌落总数与对照组的菌落总数接近；未采用TTC的PCA组，因为牛奶本身的颜色、麦片的细小颗粒物导致培养基上一些颜色和样品本底颜色接近的菌落以及与细小颗粒物接近或者生长时叠加在样品颗粒物上时，会导致菌落无法被观察到，从而使得检测结果与真实值有一定的差异。虽然未加TTC组的数据也符合ISO 4833中重复性的要求（小于0.25log10N），但0.0015%TTC的PCA组更有利于菌落的观察和计数，减少了因样品本身的性状、颜色对检测结果的影响，使检测结果更加准确可靠。
三、总结与讨论
食品在实际加工过程中以及原料被污染的细菌种类较多，本次试验选取了比较有代表性的3种菌种进行方法确认，主要验证在商业干粉培养基配制过程中添加一定浓度的TTC便于对实验结果的观察和计数，同时验证了最佳的使用浓度，既方便观察，又对检测结果没有影响，能够提高本身颜色较特殊以及含有细小颗粒的样品菌落总数检测项目的准确性。
参照《化妆品安全技术规范》（2015年版）第五章微生物检验方法中菌落总数检验方法的描述内容，为了便于區别化妆品中的颗粒与菌落，可在培养基中加入TTC（红四氮唑，又叫2，3，5-三苯基氯化四氮唑）溶液，利用TTC在菌落生长过程中产生的琥珀脱氢酶使无色的TTC还原成红色的TPF原理，使菌落更容易观察和计数。但对于TTC的浓度，各类文献给出的结果不完全一致，本文选择自然界中比较常见的革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌-大肠埃希氏菌以及芽孢菌-枯草芽孢杆菌作为试验菌种，以麦片和乳粉为样品基质，对TTC的浓度进行确认，确定最佳使用浓度，对食品中菌落总数的检测方法进行优化，从而提高检测结果的准确性。
一、材料
平板计数琼脂，北京陆桥；营养肉汤，北京路桥；培养皿，瑾博；TTC，麦克林；大肠埃希氏菌，ATCC 8739；金黄色葡萄球菌，ATCC 6538；枯草芽孢杆菌，ATCC 9372；生物安全柜，1384；恒温培养箱，DHP-9162；电子天平，MP3KC；移液器，GP00180。
二、方法
1.菌种的制备。各取1环工作菌种接种至9mL的营养肉汤中，在36℃条件下培养18-24小时，此时的菌种浓度约为1.0×109CFU/mL。使用无菌生理盐水对菌液进行稀释，根据常用的食品安全标准，食品中的大部分限量值为103-105CFU/g，因此将菌液浓度稀释至105CFU/mL、106CFU/mL备用。
2.不同浓度TTC平板计数琼脂制备。配制平板计数琼脂，经121℃灭菌15分钟后置于60℃的水浴中，将TTC用无菌水配制成5%的浓度，过滤除菌后备用。以无菌操作添加到平板计数琼脂中，使得平板计数琼脂中TTC的浓度分别为0.08%、0.06%、0.04%、0.02%、0.01%、0.008%、0.004%、0.002%、0.001%、0.0008%、0.0004%、0.0002%、0.0001%，制备好后放在48℃的水浴中备用。
3.操作步骤。取制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌1mL至培养皿中，每个浓度TTC的培养基准备2个培养皿，加入含不同浓度TTC的PCA培养基和2个不含TTC的培养基作为对照组。培养基凝固后反转培养皿，在36℃条件下培养48小时。金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌在含不同浓度TTC培养基中的菌落计数及菌落颜色如表1所示。
由表1可知，当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0020%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的金黄色葡萄球菌的菌落数相比无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对金黄色葡萄球菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0020%。当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0080%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的大肠埃希氏菌的菌落数无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对大肠埃希氏菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0080%。当TTC浓度≥0.0010%时，菌落呈现粉红色，颜色的辨识度较明显；当TTC浓度≤0.0080%时，菌落总数的数值与不添加TTC培养基的枯草芽孢杆菌的菌落数无明显减少（差异小于0.25log10N），因此对枯草芽孢杆菌的最佳使用浓度范围为0.0010%-0.0080%。结合三种菌种的试验结果，食品中TTC的浓度在0.0010%- 0.0020%之间较为适宜。
4.在具体产品中的验证方法。设计麦片和牛奶两类产品样品，为了结果便于统计，将牛奶和麦片进行高压灭菌冷却后，称取25g的麦片和25mL的牛奶于均质袋中，每个样品称取3个平行。将制备好的菌液分别各取1份混合，使得混合后的菌液浓度约为105CFU/mL，每个样品的加菌量为1mL，使得样品的最终浓度为103CFU/g，加入225mL的稀释液后得到10-1稀释液，按照梯度稀释到10-2、10-3稀释液。每个稀释度取各取1mL至4个无菌培养皿中，2个培养皿中加入15-20mL含0.0015%TTC的PCA培养基，另外2个培养皿中加入不含TTC的PCA培养基。用25mL的无菌稀释液代替样品作为对照组，加入不含TTC的PCA培养基。待上述培养基冷却凝固后，反转培养皿并在36℃条件下培养48小时，然后取出计数，计算平均结果如表2。
从表2可以看出，当采用含0.0015%TTC的PCA时，样品中的菌落总数与对照组的菌落总数接近；未采用TTC的PCA组，因为牛奶本身的颜色、麦片的细小颗粒物导致培养基上一些颜色和样品本底颜色接近的菌落以及与细小颗粒物接近或者生长时叠加在样品颗粒物上时，会导致菌落无法被观察到，从而使得检测结果与真实值有一定的差异。虽然未加TTC组的数据也符合ISO 4833中重复性的要求（小于0.25log10N），但0.0015%TTC的PCA组更有利于菌落的观察和计数，减少了因样品本身的性状、颜色对检测结果的影响，使检测结果更加准确可靠。
三、总结与讨论
食品在实际加工过程中以及原料被污染的细菌种类较多，本次试验选取了比较有代表性的3种菌种进行方法确认，主要验证在商业干粉培养基配制过程中添加一定浓度的TTC便于对实验结果的观察和计数，同时验证了最佳的使用浓度，既方便观察，又对检测结果没有影响，能够提高本身颜色较特殊以及含有细小颗粒的样品菌落总数检测项目的准确性。