【摘 要】
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目的研究提纯并鉴定牙龈卟啉单胞菌(P.g)W83牙龈蛋白酶的方法,探讨牙龈蛋白酶对人成骨细胞系hFOB增殖及凋亡的影响。方法丙酮沉淀P.gW83上清,经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白
【机 构】
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中山大学光华口腔医学院·,附属口腔医院
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目的研究提纯并鉴定牙龈卟啉单胞菌(P.g)W83牙龈蛋白酶的方法,探讨牙龈蛋白酶对人成骨细胞系hFOB增殖及凋亡的影响。方法丙酮沉淀P.gW83上清,经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白酶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离牙龈蛋白酶条带;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/源后衰变法(MALDI-TOF-MS/MS+MS)鉴定牙龈蛋白酶提取物;底物发色法测定牙龈蛋白酶活性;牙龈蛋白酶与人成骨细胞系hFOB1.19共培养,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或CCK-8检测细胞凋亡或增殖。结果 P.gW83牙龈蛋白酶提取物经SDS-PAGE分离出50kDa蛋白条带,MALDI-TOF-MS/MS+MS鉴定其为精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Rgps)。底物发色法测定Rgps、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Kgp)活性分别为75.62、10.51U/L,5mmol/L半胱氨酸蛋白酶抑制剂TLCK对Rgps、Kgp活性抑制分别为99.51%、99.00%(P<0.01)。牙龈蛋白酶(Rgps活性15.12U/L、Kgp活性2.10U/L)与hFOB共培养8h可诱导细胞发生凋亡,出现典型的细胞核染色质凝聚,且随时间增加hFOB凋亡率逐渐上升,16～24h达到高峰。CCK-8法检测显示,牙龈蛋白酶呈时间依赖性抑制hFOB增殖。结论丙酮沉淀P.gW83上清,经重悬、透析、超滤提纯的牙龈蛋白酶主要成分是Rgps;底物发色法测定Rgps/Kgp活性,方法稳定、可靠;牙龈蛋白酶抑制hFOB增殖且促进凋亡。
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