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【摘要】利用免疫组化和血清药理学等实验方法,对颤复宁治疗帕金森病的机理进行系统研究,得出结论:颤复宁对帕金森病大鼠模型有一定的治疗作用,颤复宁血清保护组可维持较高的细胞存活率,其保护作用有明显的剂量依赖效应。
【关键词】帕金森病;中药颤复宁;多巴胺能神经元
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又称震颤麻痹,是影响中老年人身体健康的主要神经退行性疾病,其病因仍然不清。本课题所用“颤复宁”复方中药,应用于临床近20年,取得了良好的治疗效果。本研究用6-羟基多巴(6-OHDA)损伤制作的PD体内和体外模型,利用血清药理学方法,在抗氧化、抗凋亡等方面对颤复宁治疗PD的机理进行了系统研究。旨在为中药颤复宁治疗PD提供实验依据,为PD治疗提供新思路。
1方法
1.1实验方法本研究首先用6-OHDA两点注射右侧纹状体制作单侧PD大鼠模型,注射等剂量的生理盐水的假手术组为对照。实验共分3组,每组6只:对照组、模型组和中药治疗组,对照组和模型组生理盐水灌胃,中药治疗组同时间等剂量中药颤复宁灌胃,连续灌胃30天后,观察阿朴吗啡诱导的行为学改变,及用免疫组化染色检测各组大鼠黑质部位TH阳性神经元数量及纹状体TH阳性纤维密度的改变,分析颤复宁对PD大鼠模型的治疗作用。然后用血清药理学方法制备中药颤复宁大鼠血清和对照大鼠血清用于体外研究。选用Wistar孕大鼠15～16天的胚胎原代中脑黑质神经元为实验材料,100μM6-OHDA作用24小时作为PD的体外模型。观察中药颤复宁大鼠血清对多巴胺神经元的保护作用并探讨其作用机理。本次实验分3组:对照组,即对照鼠血清培养;6-OHDA损伤组,即对照鼠血清+100μM6-OHDA;中药保护组,即中药鼠血清+100μM6-OHDA。用MTT法检测各组细胞的生长活性。TH免疫细胞化学染色检测多巴胺神经元的数量、突起长度、细胞胞体面积。Flou-3-AM对细胞进行荧光染色后,用激光扫描共聚焦显微镜检测各组细胞内Ca2+浓度变化并进行图像采集及荧光强度定量分析。生化方法测定各组细胞内GSH和MDA含量的变化。最后用100μM 6-OHDA加入到体外培养的PC12细胞培养液中制作PD的体外型,中药血清制备,分3组,每组6只大鼠。用MTT法测各组细胞的存活率,并用免疫组织化学染色方法和图像分析检测TH的含量及半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)阳性细胞数。
1.2 统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,各指标均以均数±标准差(x±s)表示,分类资料统计分析采用X2检验, 计量资料采用两样本t检验,P<0.05表示两组差异有统计学意义。
2结果
2.1制作PD大鼠模型实验结果显示,中药颤复宁对阿朴吗啡诱导的旋转行为有明显改善,旋转圈数与模型组相比较明显减少(P值<0.05);PD大鼠模型毁损侧黑质部位多巴胺神经元明显减少,纹状体部位多巴胺神经元纤维终末光密度值明显降低,与模型组相比,中药治疗组大鼠毁损侧黑质多巴胺神经元数量明显增多,纹状体部位TH阳性纤维的相对光密度值明显增强,两者有统计学差异,P<0.05。
2.2 血清药理学实验结果显示,颤复宁血清保护组的OD值高于6-OHDA损伤组,其可维持较高的细胞存活率,且其保护作用呈明显的剂量依赖效应关系变化。6-OHDA损伤后,对照血清组多巴胺神经元数量明显减少,细胞内钙离子浓度升高。而颤复宁血清保护组TH阳性细胞数量多,多巴胺神经元最大突起长度长,其细胞内钙离子浓度明显降低(P<0.05)。6-OHDA损伤组中脑黑质神经元细胞内GSH浓度明显下降,MDA含量增高(P<0.05);而加入中药颤复宁大鼠血清后,黑质神经元GSH浓度增加,MDA含量下降,与6-OHDA损伤组相比有明显差异(P<0.01)。
2.3颤复宁中药血清能有效提高PC12细胞的存活率,其OD值明显高于6-OHDA 损伤组。与6-OHDA损伤组比较,颤复宁血清组TH阳性细胞平均吸光度增高(P<0.05);Caspase-3阳性细胞数明显降低(P<0.01)。
3讨论
本研究发现,中药颤复宁血清能提高多巴胺神经元的生长活性,平衡细胞内钙离子浓度,通过降低细胞内钙离子浓度,抑制由钙超载引起的多巴胺神经元的凋亡。中药颤复宁对PD大鼠模型有较好的治疗作用,对体外培养的多巴胺神经元有较强的营养和保护作用,其作用机理主要有以下两个方面:一是提高抗氧化指标还原型谷胱甘肽含量,降低氧自由基引起的氧化作用;二是提高神经元钙结合蛋白D28K mRNA的含量,及降低Caspase-3的含量,抑制由钙离子超载引起的细胞凋亡。中药颤复宁血清对PC12细胞具有直接的神经营养作用,能提高细胞的存活率,且对6-OHDA诱导的细胞凋亡具有抑制作用。本研究通过体内和体外实验的相互结合,首次对临床上具有确定疗效的中药复方颤复宁进行了系统研究,在细胞和分子水平上为颤复宁治疗PD的作用机制提供实验依据,也为中药治疗PD的实验研究提供新的方法依据。
参考文献
[1]梁希彬,周宇,谢俊霞等.大鼠帕金森病模型的建立及其评价[J].中国神经科学杂志,2006,16(1):65-67.
[2] 胡国华,马敬红,宋月平等.纹状体内注射6-OHDA制备帕金森病大鼠模型的实验研究[J].中风与神经疾病研究,2004,20(5):442-444.
【关键词】帕金森病;中药颤复宁;多巴胺能神经元
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又称震颤麻痹,是影响中老年人身体健康的主要神经退行性疾病,其病因仍然不清。本课题所用“颤复宁”复方中药,应用于临床近20年,取得了良好的治疗效果。本研究用6-羟基多巴(6-OHDA)损伤制作的PD体内和体外模型,利用血清药理学方法,在抗氧化、抗凋亡等方面对颤复宁治疗PD的机理进行了系统研究。旨在为中药颤复宁治疗PD提供实验依据,为PD治疗提供新思路。
1方法
1.1实验方法本研究首先用6-OHDA两点注射右侧纹状体制作单侧PD大鼠模型,注射等剂量的生理盐水的假手术组为对照。实验共分3组,每组6只:对照组、模型组和中药治疗组,对照组和模型组生理盐水灌胃,中药治疗组同时间等剂量中药颤复宁灌胃,连续灌胃30天后,观察阿朴吗啡诱导的行为学改变,及用免疫组化染色检测各组大鼠黑质部位TH阳性神经元数量及纹状体TH阳性纤维密度的改变,分析颤复宁对PD大鼠模型的治疗作用。然后用血清药理学方法制备中药颤复宁大鼠血清和对照大鼠血清用于体外研究。选用Wistar孕大鼠15～16天的胚胎原代中脑黑质神经元为实验材料,100μM6-OHDA作用24小时作为PD的体外模型。观察中药颤复宁大鼠血清对多巴胺神经元的保护作用并探讨其作用机理。本次实验分3组:对照组,即对照鼠血清培养;6-OHDA损伤组,即对照鼠血清+100μM6-OHDA;中药保护组,即中药鼠血清+100μM6-OHDA。用MTT法检测各组细胞的生长活性。TH免疫细胞化学染色检测多巴胺神经元的数量、突起长度、细胞胞体面积。Flou-3-AM对细胞进行荧光染色后,用激光扫描共聚焦显微镜检测各组细胞内Ca2+浓度变化并进行图像采集及荧光强度定量分析。生化方法测定各组细胞内GSH和MDA含量的变化。最后用100μM 6-OHDA加入到体外培养的PC12细胞培养液中制作PD的体外型,中药血清制备,分3组,每组6只大鼠。用MTT法测各组细胞的存活率,并用免疫组织化学染色方法和图像分析检测TH的含量及半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)阳性细胞数。
1.2 统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,各指标均以均数±标准差(x±s)表示,分类资料统计分析采用X2检验, 计量资料采用两样本t检验,P<0.05表示两组差异有统计学意义。
2结果
2.1制作PD大鼠模型实验结果显示,中药颤复宁对阿朴吗啡诱导的旋转行为有明显改善,旋转圈数与模型组相比较明显减少(P值<0.05);PD大鼠模型毁损侧黑质部位多巴胺神经元明显减少,纹状体部位多巴胺神经元纤维终末光密度值明显降低,与模型组相比,中药治疗组大鼠毁损侧黑质多巴胺神经元数量明显增多,纹状体部位TH阳性纤维的相对光密度值明显增强,两者有统计学差异,P<0.05。
2.2 血清药理学实验结果显示,颤复宁血清保护组的OD值高于6-OHDA损伤组,其可维持较高的细胞存活率,且其保护作用呈明显的剂量依赖效应关系变化。6-OHDA损伤后,对照血清组多巴胺神经元数量明显减少,细胞内钙离子浓度升高。而颤复宁血清保护组TH阳性细胞数量多,多巴胺神经元最大突起长度长,其细胞内钙离子浓度明显降低(P<0.05)。6-OHDA损伤组中脑黑质神经元细胞内GSH浓度明显下降,MDA含量增高(P<0.05);而加入中药颤复宁大鼠血清后,黑质神经元GSH浓度增加,MDA含量下降,与6-OHDA损伤组相比有明显差异(P<0.01)。
2.3颤复宁中药血清能有效提高PC12细胞的存活率,其OD值明显高于6-OHDA 损伤组。与6-OHDA损伤组比较,颤复宁血清组TH阳性细胞平均吸光度增高(P<0.05);Caspase-3阳性细胞数明显降低(P<0.01)。
3讨论
本研究发现,中药颤复宁血清能提高多巴胺神经元的生长活性,平衡细胞内钙离子浓度,通过降低细胞内钙离子浓度,抑制由钙超载引起的多巴胺神经元的凋亡。中药颤复宁对PD大鼠模型有较好的治疗作用,对体外培养的多巴胺神经元有较强的营养和保护作用,其作用机理主要有以下两个方面:一是提高抗氧化指标还原型谷胱甘肽含量,降低氧自由基引起的氧化作用;二是提高神经元钙结合蛋白D28K mRNA的含量,及降低Caspase-3的含量,抑制由钙离子超载引起的细胞凋亡。中药颤复宁血清对PC12细胞具有直接的神经营养作用,能提高细胞的存活率,且对6-OHDA诱导的细胞凋亡具有抑制作用。本研究通过体内和体外实验的相互结合,首次对临床上具有确定疗效的中药复方颤复宁进行了系统研究,在细胞和分子水平上为颤复宁治疗PD的作用机制提供实验依据,也为中药治疗PD的实验研究提供新的方法依据。
参考文献
[1]梁希彬,周宇,谢俊霞等.大鼠帕金森病模型的建立及其评价[J].中国神经科学杂志,2006,16(1):65-67.
[2] 胡国华,马敬红,宋月平等.纹状体内注射6-OHDA制备帕金森病大鼠模型的实验研究[J].中风与神经疾病研究,2004,20(5):442-444.