【摘 要】
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【目的】克隆鸡γ-干扰素(chIFNγ-)基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFNγ-成熟蛋白基因c
【机 构】
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山东省农业科学院畜牧兽医研究所,DepartmentofPathobiology
【基金项目】
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山东省农业科学院高技术自主创新基金(2006YCX023)~~
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【目的】克隆鸡γ-干扰素(chIFNγ-)基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFNγ-成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a(+)-chIFNγ-,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp的chIFNγ-成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFNγ-蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1∶32稀释纯化的重组chIFNγ-(rchIFNγ-)孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFNγ-具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。
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