ROCK抑制剂Y-27632在角膜保存时对角膜缘干细胞活性的促进作用

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背景

角膜缘干细胞(LSCs)对维持角膜上皮的稳定和角膜组织透明性有重要作用。Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632能够促进人胚胎干细胞、角质上皮细胞等的增生,减少细胞凋亡。

目的

探讨Y-27632对离体兔角膜保存和体外LSCs扩增能力的影响。

方法

在细胞培养基MEM中加入质量分数12. 5%硫酸软骨素、质量分数10. 0%低分子右旋糖酐、20. 0 mg/L地塞米松、100 mg/L妥布霉素注射液、9. 5 g/L Hepes,使用时添加0. 375 mg/L L-谷氨酰胺,制备成角膜活性保存液。将新西兰大白兔的角膜组织片分别置于含或不含Y-27632的角膜活性保存液中保存4、7、14 d,采用质量分数0. 25%锥虫蓝和质量分数0. 2%茜素红染色法观察角膜内皮细胞密度及形态,采用Giemsa染色法并使用Image J图像分析软件计数克隆球数量和LSCs活性,计算LSCs存活率和克隆形成效率。

结果

角膜片保存4 d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞形态无明显差别,角膜片保存7 d时,Y-27632保存液组角膜内皮细胞形态仍保持规则的六边形,而单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞的细胞膜轻微皱缩,少数细胞体积变大。角膜片保存14 d时单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞可见较多的茜素红斑。单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞计数为(2 262±75)/mm2,Y-27632保存液组角膜内皮细胞计数为(2 425±95)/mm2,差异有统计学意义(P<0. 001)。新鲜角膜片和角膜片保存4 d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆球均较大,其内细胞数较多,而保存7 d和14 d时,与Y-27632保存液组比较,单纯角膜中期保存液组LSCs克隆球直径明显缩小。新鲜分离的角膜片和角膜片保存4 d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成率和角膜上皮细胞存活率的差异均无统计学意义(均P>0. 05);角膜片保存7 d和14 d时,角膜缘上皮细胞的活性率分别为(73. 00±2. 12)%和(56. 00±0. 71)%,明显高于单纯角膜中期培养液组的(66. 00±4. 00)%和(49. 00±0. 71)%,差异均有统计学意义(t=3. 098,P=0. 018;t=9. 798,P=0. 000);角膜片保存7 d和14 d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成效率分别为(11. 05±0. 21)%和(3. 10±1. 97)%,明显高于单纯角膜中期保存液组中的(2. 05±1. 20)%和(0. 40±0. 14)%,差异均有统计学意义(t=18. 107,P=0. 000;t=3. 184,P=0. 017)。

结论

角膜保存液中添加Y-27632可明显提高离体角膜保存的效果,同时可维持LSCs的活性及克隆形成能力。Y-27632可作为角膜保存液的有效添加成分。

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