【摘 要】
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目的 以乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)全基因为外源片段,构建酵母双杂交体系中结合域载体,研究其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用及毒性作用,验证其适用性.方法根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物,取患者血清,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段,克隆入T载体,酶切鉴定及序列测定后,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7-eAg载体.再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵
【机 构】
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100039,北京,解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室,100039,北京,解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室,100039,北京,解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室,100039,
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目的 以乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)全基因为外源片段,构建酵母双杂交体系中结合域载体,研究其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用及毒性作用,验证其适用性.方法根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物,取患者血清,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段,克隆入T载体,酶切鉴定及序列测定后,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7-eAg载体.再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母,验证毒性作用;通过Western-bolt实验证实外源基因在酵母中的表达;并进一步验证自身激活作用.结果由血清中分离的及2次酶切鉴定的片段大小分别为657 bp和639 bp,与预期大小一致;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96%和100%;转人酵母后无毒性及自身激活作用;Western-blot实验出现阳性与预期大小(24.3×103)一致的条带.结论pGBKT7-eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白,进一步验证无自身激活及毒性作用,此载体构建成功,适用于酵母双杂交体系。
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