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摘 要：根据狐狸线粒体DNA（mtDNA）序列设计了狐狸特异性引物和探针，建立了食品中狐狸源性成分的实时荧光PCR检测方法。该方法的检测灵敏度可达0.1pg，而且与常见的12个物种无交叉反应，可作为食品中狐狸源性成分鉴别的有效方法。
关键词：实时荧光PCR 狐狸源性 线粒体DNA 清真食品
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）12（c）-0109-03
我国少数民族众多，遍布各个省份，其中回族、维吾尔族、哈萨克族等少数民族信奉伊斯兰教。他们在饮食、起居等方面形成了独具特色的风俗习惯，尤其在饮食方面有着严格的宗教特色禁忌，禁食奇形怪状、污秽不洁、性情凶恶、行为怪异的飞禽、猛兽及鱼类等食物以及不反刍的动物，如猪、狗、猫、鼠、蛇、驴、马、骡、狗、狐狸等[1]。
狐狸作为一种经济附加值很高的畜类，在中国广泛养殖，人们主要通过饲养狐狸获取其皮毛制作衣服、围巾等产品。在将狐狸剥去皮后，剩余的肉及内脏就成为了“废物”，一些不法商贩将废肉低价买入再将其送往食品加工厂做成牛肉、羊肉、狗肉等制品并高价卖出，从中获得暴利。由于狐狸肉没有通过检验检疫，带有大量的病毒、细菌、寄生虫，而且为了得到光泽好的高质量的皮毛，养殖户会给狐狸喂食激素。这不仅仅是食品安全问题，更涉及到人们身体健康和宗教信仰等问题[1]。因此，对于肉制品中掺假的检测显得尤其重要。
动物源性检测手段主要有蛋白分析法和核酸分析法，但由于蛋白分析法要求样品不能经过高温等能使蛋白变性的烹饪手段，这就极大地限制了其在实际生活中的应用[1]。随着分子生物学的进步，PCR技术很好地解决了这一问题。实时定量荧光PCR可以实时检测目标片段的表达情况，是目前检测食品中动物源性成分的主要手段，它有着专一性强、对样品加工程度要求低等特点[2]。目前已有关于猪、牛、羊、马、驴、兔[4-5]动物源性成分分析的报道，但采用实时定量荧光PCR法检测清真食品中狐狸源性还鲜有报道。本实验选择狐狸线粒体设计引物和探针，建立快速准确地检测清真食品中狐狸源性成分的实时定量荧光PCR检测方法，给食品掺假检测以及规范清真食品市场提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品及来源
肉及其制品包括牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、驴、马、狗、狐狸。猪、牛、羊、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑采购自超市，驴、马采购自餐馆，狐狸采购自银川市西夏区兆群狐狸养殖合作社，犬血液购自银川市兴庆区宠康动物诊所。
1.1.2 实验试剂
基因组DNA提取试剂盒购自于大连TAKARA公司； PCR扩增纯化试剂盒，购自于Promager公司。
1.1.3 实验仪器
实时荧光定量PCR仪（Eppendorf公司）；高速冷冻离心机（日本HTACHI公司）；恒温加热器（HAITEC公司）。
1.1.4 引物及探针的设计
根据NCBI基因数据库中公布的基因数据，选择狐狸细胞色素b基因[3]，在线粒体DNA的区域设计了用于检测狐狸DNA的特异性引物和探针，此外，为了防止假阴性结果的出现以及监控PCR反应的正常与否，在真核生物的16sRNA保守区域设计了通用上下游引物。引物及探针的序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 样品DNA的提取
采用TAKARA公司基因组DNA提取试剂盒，具体步骤：
（1）称取10mg样品加入Ep管中，充分剪碎；（2）70℃加热10min，其间指弹2～3次；（3）12000rpm、4℃离心10min，取200μL上清于新离心管中备用。阴性样品同样通过该法提取DNA，溶解于100μL TE溶液中备用。
1.2.2 实时荧光PCR反应
反应体系40μL：PCR Mix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，探針（5μM）2μL，模板DNA（10～50ng）2μL，无菌水补至40μL。
反应条件为：50℃保温2min，95℃预变性2min，95℃变性15s、60℃延伸45s进行40个循环，同时扩增目标物和内参。
1.2.3 特异性实验
为了考察本研究特异性，取1.1中所有样品的制作模板。根据1.2.2的反应体系和反应条件分别扩增。通用引物同步扩增[5]。
1.2.4 灵敏度实验
将狐狸DNA溶液稀释至10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%，以含量不同的狐狸DNA样品为模板，进行PCR反应，用于确定方法的灵敏度。
1.2.5 重复性与稳定性验证
将狐狸DNA作为模板，按照1.2.2所述的反应体系与反应条件进行扩增，同一模板进行7次扩增反应，研究所建立体系的稳定性。
2 结果与讨论
2.1 狐狸源性成分特异性分析
用设计的狐狸源性引物和探针分别对12种样品的DNA进行实时荧光PCR，结果如表2所示，Ct值的平均值为15.16，其余物种均无扩增，由此可见本研究所设计的狐狸源性引物和探针特异性良好。
2.2 灵敏度试验结果
用特异性的引物和探针，以狐狸DNA含量分别为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%为模板扩增，结果见图1和图2。由图1和图2可知：当狐狸成分含量低至0.0001%时，仍能够呈现S型扩增曲线并且Ct值<35，说明本方法可检出10-4ng的DNA量，因此方法的灵敏度为0.1pg。在10%至0.00001%浓度范围内，建立Ct值-DNA含量的标准曲线，R2为0.996，线性相关度良好。
2.3 重复性与稳定性试验结果
狐狸源性成分重复性试验结果Ct值见表3。经统计学分析表明，实验稳定性和重复性良好，结果无显著性差异。
3 讨论与结论
3.1 目的基因的选择
之所以会选择线粒体细胞色素b，是因为狐狸的细胞色素b相对使用其余DNA片段作为物种鉴定的靶序列具有以下优点：（1）细胞色素b具有广泛的种内和种间多样性，比核DNA进化速度快，适于亲缘相近物种的鉴别。（2）每个线粒体含2～6个环状DNA，在数量上远超过核DNA，适于加工样品的分析。（3）细胞色素b在不同的物种中具有较高的变异性，特异性较强。
3.2 检出限的确定
狐狸源性成分灵敏度试验0.1%、0.01%含量检测的Ct值均<35.0，但是为了区分偶然性和蓄意掺假，同时考虑检测过程中的实际意义，将检出限确定为0.1%。
参考文献
[1] 岳苑.实时荧光PCR法检测清真食品中马、驴源性成分[J].湖北农业科学，2014，53（22）：5519-5521.
[2] 陈茹，林志雄，刘琳琳.应用PCR等核酸技术检验动物饲料中牛羊组织成分[J].中国兽医科技，2001，31（9）：3-8.
[3] 曹际娟，卢行安，秦成，等.实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技术通讯，2002，13（2）：158-160.
[4] 杨宝华，宗卉.根据线粒体基因的特异性鉴别检测饲料中的动物源性成分[J].科学试验与研究，2000（5）：1-3.
[5] Wang Q，Zhang X，Zhang HY，et al.Identification of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene[J].Meat Science，2010，85（2）：265-269.
关键词：实时荧光PCR 狐狸源性 线粒体DNA 清真食品
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）12（c）-0109-03
我国少数民族众多，遍布各个省份，其中回族、维吾尔族、哈萨克族等少数民族信奉伊斯兰教。他们在饮食、起居等方面形成了独具特色的风俗习惯，尤其在饮食方面有着严格的宗教特色禁忌，禁食奇形怪状、污秽不洁、性情凶恶、行为怪异的飞禽、猛兽及鱼类等食物以及不反刍的动物，如猪、狗、猫、鼠、蛇、驴、马、骡、狗、狐狸等[1]。
狐狸作为一种经济附加值很高的畜类，在中国广泛养殖，人们主要通过饲养狐狸获取其皮毛制作衣服、围巾等产品。在将狐狸剥去皮后，剩余的肉及内脏就成为了“废物”，一些不法商贩将废肉低价买入再将其送往食品加工厂做成牛肉、羊肉、狗肉等制品并高价卖出，从中获得暴利。由于狐狸肉没有通过检验检疫，带有大量的病毒、细菌、寄生虫，而且为了得到光泽好的高质量的皮毛，养殖户会给狐狸喂食激素。这不仅仅是食品安全问题，更涉及到人们身体健康和宗教信仰等问题[1]。因此，对于肉制品中掺假的检测显得尤其重要。
动物源性检测手段主要有蛋白分析法和核酸分析法，但由于蛋白分析法要求样品不能经过高温等能使蛋白变性的烹饪手段，这就极大地限制了其在实际生活中的应用[1]。随着分子生物学的进步，PCR技术很好地解决了这一问题。实时定量荧光PCR可以实时检测目标片段的表达情况，是目前检测食品中动物源性成分的主要手段，它有着专一性强、对样品加工程度要求低等特点[2]。目前已有关于猪、牛、羊、马、驴、兔[4-5]动物源性成分分析的报道，但采用实时定量荧光PCR法检测清真食品中狐狸源性还鲜有报道。本实验选择狐狸线粒体设计引物和探针，建立快速准确地检测清真食品中狐狸源性成分的实时定量荧光PCR检测方法，给食品掺假检测以及规范清真食品市场提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品及来源
肉及其制品包括牛、羊、猪、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、驴、马、狗、狐狸。猪、牛、羊、鱼、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑采购自超市，驴、马采购自餐馆，狐狸采购自银川市西夏区兆群狐狸养殖合作社，犬血液购自银川市兴庆区宠康动物诊所。
1.1.2 实验试剂
基因组DNA提取试剂盒购自于大连TAKARA公司； PCR扩增纯化试剂盒，购自于Promager公司。
1.1.3 实验仪器
实时荧光定量PCR仪（Eppendorf公司）；高速冷冻离心机（日本HTACHI公司）；恒温加热器（HAITEC公司）。
1.1.4 引物及探针的设计
根据NCBI基因数据库中公布的基因数据，选择狐狸细胞色素b基因[3]，在线粒体DNA的区域设计了用于检测狐狸DNA的特异性引物和探针，此外，为了防止假阴性结果的出现以及监控PCR反应的正常与否，在真核生物的16sRNA保守区域设计了通用上下游引物。引物及探针的序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 样品DNA的提取
采用TAKARA公司基因组DNA提取试剂盒，具体步骤：
（1）称取10mg样品加入Ep管中，充分剪碎；（2）70℃加热10min，其间指弹2～3次；（3）12000rpm、4℃离心10min，取200μL上清于新离心管中备用。阴性样品同样通过该法提取DNA，溶解于100μL TE溶液中备用。
1.2.2 实时荧光PCR反应
反应体系40μL：PCR Mix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，探針（5μM）2μL，模板DNA（10～50ng）2μL，无菌水补至40μL。
反应条件为：50℃保温2min，95℃预变性2min，95℃变性15s、60℃延伸45s进行40个循环，同时扩增目标物和内参。
1.2.3 特异性实验
为了考察本研究特异性，取1.1中所有样品的制作模板。根据1.2.2的反应体系和反应条件分别扩增。通用引物同步扩增[5]。
1.2.4 灵敏度实验
将狐狸DNA溶液稀释至10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%，以含量不同的狐狸DNA样品为模板，进行PCR反应，用于确定方法的灵敏度。
1.2.5 重复性与稳定性验证
将狐狸DNA作为模板，按照1.2.2所述的反应体系与反应条件进行扩增，同一模板进行7次扩增反应，研究所建立体系的稳定性。
2 结果与讨论
2.1 狐狸源性成分特异性分析
用设计的狐狸源性引物和探针分别对12种样品的DNA进行实时荧光PCR，结果如表2所示，Ct值的平均值为15.16，其余物种均无扩增，由此可见本研究所设计的狐狸源性引物和探针特异性良好。
2.2 灵敏度试验结果
用特异性的引物和探针，以狐狸DNA含量分别为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%和0.00001%为模板扩增，结果见图1和图2。由图1和图2可知：当狐狸成分含量低至0.0001%时，仍能够呈现S型扩增曲线并且Ct值<35，说明本方法可检出10-4ng的DNA量，因此方法的灵敏度为0.1pg。在10%至0.00001%浓度范围内，建立Ct值-DNA含量的标准曲线，R2为0.996，线性相关度良好。
2.3 重复性与稳定性试验结果
狐狸源性成分重复性试验结果Ct值见表3。经统计学分析表明，实验稳定性和重复性良好，结果无显著性差异。
3 讨论与结论
3.1 目的基因的选择
之所以会选择线粒体细胞色素b，是因为狐狸的细胞色素b相对使用其余DNA片段作为物种鉴定的靶序列具有以下优点：（1）细胞色素b具有广泛的种内和种间多样性，比核DNA进化速度快，适于亲缘相近物种的鉴别。（2）每个线粒体含2～6个环状DNA，在数量上远超过核DNA，适于加工样品的分析。（3）细胞色素b在不同的物种中具有较高的变异性，特异性较强。
3.2 检出限的确定
狐狸源性成分灵敏度试验0.1%、0.01%含量检测的Ct值均<35.0，但是为了区分偶然性和蓄意掺假，同时考虑检测过程中的实际意义，将检出限确定为0.1%。
参考文献
[1] 岳苑.实时荧光PCR法检测清真食品中马、驴源性成分[J].湖北农业科学，2014，53（22）：5519-5521.
[2] 陈茹，林志雄，刘琳琳.应用PCR等核酸技术检验动物饲料中牛羊组织成分[J].中国兽医科技，2001，31（9）：3-8.
[3] 曹际娟，卢行安，秦成，等.实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技术通讯，2002，13（2）：158-160.
[4] 杨宝华，宗卉.根据线粒体基因的特异性鉴别检测饲料中的动物源性成分[J].科学试验与研究，2000（5）：1-3.
[5] Wang Q，Zhang X，Zhang HY，et al.Identification of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene[J].Meat Science，2010，85（2）：265-269.