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【摘 要】 目的 OTX2轉录因子通过结合到DNA序列上，改变相关基因的表达，进而导致相应的临床表现。I级POU结构域转录因子I POU1F 1（POU domain，class I，transcription factor I，POU1F1），人类OTX2基因编码区有1个高度保守的同源结构域（38-lOOaa），拟初步探讨OTX2保守编码区的63位和72位氨基酸定点突变对下游基因POU1F 1启动子的影响[1]。方法 本研究在otx2的高度保守域构建突变型OTX2表达载体，与POU1F1启动子区荧光素酶载体共转染HEK293细胞，检测下游基因POU1F 1启动子区载体的荧光素酶活性。结果 野生型OTX2可使POU1F1转录活性，3种突变型OTX2则降低了POU1F1的启动子转录活性（P<0.05）。与野生型OTX2相比，p. Pro63Gly和p. Leu72Thr均使下游基因转录活性下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 文献报道的2种OTX2突变显著降低了POU1F1启动子的转录活性；63位及72位氨基酸定点突变对POU1F1启动子转录活性无影响。
【关键词】 保守编码区 先天小眼无眼畸形 POU1F1启动子
先天性小眼球和无眼球（Anophthalmia and Microphthalmia，AM）是一种先天发育异常性眼科疾病，可单侧或双侧发生，为罕见的以眼球前后径小于正常范围或眶内眼组织完全缺如为特征的先天性眼发育异常性疾病，常合并囊肿、白内障和其他眼部异常[2]。遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等。人类OTX2基因定位于染色体14q22.23区，共含3个外显子，编码由289个氨基酸构成的转录因子，包含N末端结构域，1个高度保守的同源结构域和C末端转录激活域[3]。其中高度保守的同源结构域为DNA结合域，与DNA序列相结合，可形成螺旋-转角-螺旋结构。OTX2在发育的视泡中广泛表达，在指导视泡外翻与外胚层接触过程中起重要作用。
目前，OTX2的下游调控基因有：光间受体视黄类物质结合蛋白IRBP，ES细胞表达同源盒1 HESX1，I级POU结构域转录因子POU1F1，促性腺激素释放激素1GNRH1， BEST1等。其中， POU1F1与垂体功能相关[4]。前期文章报道新的错义突变c.203G>C[5]，位于DNA结合域的编码序列，导致蛋白质P.Arg68Pro改变，因此拟初步探讨OTX2保守编码区的63位和72位氨基酸定点突变对下游基因POU1F1启动子的影响。
1.1 材料方法
人胚肾293细胞培养相关试剂；DUAL-GLOTM双荧光素酶检测系统；TA克隆载体pMDl8-T等。构建突变型OTX2表达载体，与pGL3- POU1F1载体共转染HEK293细胞；检测荧光素酶活性。
1.2 突变引物设计
1.3构建突变型载体与转化筛选
（1）以野生型pcDNA3.1-OTX2为模板，用突变引物pcr扩增回收电泳产物，取1ul扩增产物，用DpnI内切酶酶切4h，最后回收获得突变型载体。（2）以0.004 TK/组为转染内对照，分组转染如下：0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-WT + 0.2 μg pGL3-空载体；0.2 μg pcDNA3.1-空载体 + 0.2 μg pGL3- POU1F1载体；0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-WT载体+ 0.2 μg pGL3- POU1F1载体；0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-M + 0.2 μg pGL3- POU1F1载体。（3）取5ul酶切连接产物加到50ulJMl09感受态大肠杆菌中轻轻混合，冰上放置30min；40度热休克l min，冰上放置5 min，加入950ul LB培养基中，37度水平摇；3000rpm离心3 min，弃上清，取100-200ul涂于LB琼脂平板，37度过夜培养；挑取克隆，3 ml LB培养基中37度震荡过夜培养；碱裂解法提取质粒，PCR及酶切方法鉴定重组质粒，并测序。
1.4 荧光素酶活性检测
复苏HEK293细胞，为了确保细胞良好状态接受转染，从复苏到细胞转染至少传至2代。设定突变组，野生组还有PGL3-basic空载体作为对照。弃细胞液，用pbs洗涤细胞；加入20ulPLB，震荡16min；移入荧光素酶检测管中，每管加入80ulLARII，检测荧光强度值；再分别每管加入80ulstop reagent，检测荧光值；计算比值。
1.5 数据的统计学分析
采用spss19.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，以P<0.05为有差异统计学意义。
2 结果
3种突变型OTX2对POU1F1启动子的转录活性均降低（P<0.05）；与野生型OTX2相比，p. Pro63Gly和p. Leu72Thr转录活性下降，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
2种已报道的OTX2突变均可使POU1F1的启动子转录活性下降；2种OTX2定点突变对POU1F1启动子转录活性无影响。
参考文献
[1].K.F. Schilter， A. Schneider， T. Bardakjian， J.F. Soucy， R.C. Tyler， L.M. Reis， E.V. Semina， OTX2 microphthalmia syndrome： four novel mutations and delineation of a phenotype， Clin. Genet. 79 （2011） 158-168.
[2].B. K llén， E. Robert， J. Harris， The descriptive epidemiology of anophthalmia and microphthalmia， Int. Epidemiol. 25 （1996） 1009-1016.
[3].N.K. Ragge， I.D. Subak-Sharpe， J.R. Collin， A practical guide to the management of anophthalmia and microphthalmia， Eye 21 （2007） 1290-1300.
[4].A.S. Verma， D.R. Fitzpatrick， Anophthalmia and microphthalmia， Orphanet J. Rare Dis. 26 （2007） 47.
[5].Zhang X， Li S， Xiao X， et al. Mutational screening of 10 genes in Chinese patients with microphthalmia and/or coloboma. Mol Vis. 2009 ； 15：2911 -2918.
【关键词】 保守编码区 先天小眼无眼畸形 POU1F1启动子
先天性小眼球和无眼球（Anophthalmia and Microphthalmia，AM）是一种先天发育异常性眼科疾病，可单侧或双侧发生，为罕见的以眼球前后径小于正常范围或眶内眼组织完全缺如为特征的先天性眼发育异常性疾病，常合并囊肿、白内障和其他眼部异常[2]。遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等。人类OTX2基因定位于染色体14q22.23区，共含3个外显子，编码由289个氨基酸构成的转录因子，包含N末端结构域，1个高度保守的同源结构域和C末端转录激活域[3]。其中高度保守的同源结构域为DNA结合域，与DNA序列相结合，可形成螺旋-转角-螺旋结构。OTX2在发育的视泡中广泛表达，在指导视泡外翻与外胚层接触过程中起重要作用。
目前，OTX2的下游调控基因有：光间受体视黄类物质结合蛋白IRBP，ES细胞表达同源盒1 HESX1，I级POU结构域转录因子POU1F1，促性腺激素释放激素1GNRH1， BEST1等。其中， POU1F1与垂体功能相关[4]。前期文章报道新的错义突变c.203G>C[5]，位于DNA结合域的编码序列，导致蛋白质P.Arg68Pro改变，因此拟初步探讨OTX2保守编码区的63位和72位氨基酸定点突变对下游基因POU1F1启动子的影响。
1.1 材料方法
人胚肾293细胞培养相关试剂；DUAL-GLOTM双荧光素酶检测系统；TA克隆载体pMDl8-T等。构建突变型OTX2表达载体，与pGL3- POU1F1载体共转染HEK293细胞；检测荧光素酶活性。
1.2 突变引物设计
1.3构建突变型载体与转化筛选
（1）以野生型pcDNA3.1-OTX2为模板，用突变引物pcr扩增回收电泳产物，取1ul扩增产物，用DpnI内切酶酶切4h，最后回收获得突变型载体。（2）以0.004 TK/组为转染内对照，分组转染如下：0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-WT + 0.2 μg pGL3-空载体；0.2 μg pcDNA3.1-空载体 + 0.2 μg pGL3- POU1F1载体；0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-WT载体+ 0.2 μg pGL3- POU1F1载体；0.2 μg pcDNA3.1-OTX2-M + 0.2 μg pGL3- POU1F1载体。（3）取5ul酶切连接产物加到50ulJMl09感受态大肠杆菌中轻轻混合，冰上放置30min；40度热休克l min，冰上放置5 min，加入950ul LB培养基中，37度水平摇；3000rpm离心3 min，弃上清，取100-200ul涂于LB琼脂平板，37度过夜培养；挑取克隆，3 ml LB培养基中37度震荡过夜培养；碱裂解法提取质粒，PCR及酶切方法鉴定重组质粒，并测序。
1.4 荧光素酶活性检测
复苏HEK293细胞，为了确保细胞良好状态接受转染，从复苏到细胞转染至少传至2代。设定突变组，野生组还有PGL3-basic空载体作为对照。弃细胞液，用pbs洗涤细胞；加入20ulPLB，震荡16min；移入荧光素酶检测管中，每管加入80ulLARII，检测荧光强度值；再分别每管加入80ulstop reagent，检测荧光值；计算比值。
1.5 数据的统计学分析
采用spss19.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，以P<0.05为有差异统计学意义。
2 结果
3种突变型OTX2对POU1F1启动子的转录活性均降低（P<0.05）；与野生型OTX2相比，p. Pro63Gly和p. Leu72Thr转录活性下降，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
2种已报道的OTX2突变均可使POU1F1的启动子转录活性下降；2种OTX2定点突变对POU1F1启动子转录活性无影响。
参考文献
[1].K.F. Schilter， A. Schneider， T. Bardakjian， J.F. Soucy， R.C. Tyler， L.M. Reis， E.V. Semina， OTX2 microphthalmia syndrome： four novel mutations and delineation of a phenotype， Clin. Genet. 79 （2011） 158-168.
[2].B. K llén， E. Robert， J. Harris， The descriptive epidemiology of anophthalmia and microphthalmia， Int. Epidemiol. 25 （1996） 1009-1016.
[3].N.K. Ragge， I.D. Subak-Sharpe， J.R. Collin， A practical guide to the management of anophthalmia and microphthalmia， Eye 21 （2007） 1290-1300.
[4].A.S. Verma， D.R. Fitzpatrick， Anophthalmia and microphthalmia， Orphanet J. Rare Dis. 26 （2007） 47.
[5].Zhang X， Li S， Xiao X， et al. Mutational screening of 10 genes in Chinese patients with microphthalmia and/or coloboma. Mol Vis. 2009 ； 15：2911 -2918.