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摘要
采用改良的方法提取2种土壤微生物总DNA，并采用透析法对提取的DNA进行纯化，与MO BIO公司PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法进行比较，结果表明，改良的土壤微生物总DNA提取方法提取到的DNA明显高于试剂盒提取的DNA，且A260/A280及A260/A230与试剂盒提取的相差不大，片段也较大，是一种经济方便的土壤微生物总DNA提取方法，比较适合用于构建高质量的宏基因组文库。
关键词 土壤微生物;透析法;DNA含量;宏基因组文库
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）34-12041-02
A Suitable Total Microbial DNA Extraction Method for Building Genomic Library
GAO Yue
（Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture， Suzhou， Jiangsu 215008）
Abstract Improved method was used to extract soil microbial total DNA， and the dialysis method was adopted to purify DNA. Compared with PowerSoil DNA isolation Kit of MO BIO company， the obtained DNA was analyzed. DNA per gram of soil is obviously higher than that of kit method. A260 / A280 and A260 / A230 also achieves the ideal level， the segment is larger and less impurities， indicating that it is an economic and convenient soil microbes total DNA extraction method， and is more suitable for building high quality metagenomic library.
Key words Soil microbes; Dialysis method; DNA content; Metagenomic library
微生物次級代谢产物已经被证明是开发新抗菌药物的重要来源[1]。对环境样品中未培养微生物的分析表明，在实验室中采用传统的培养微生物方法来筛选微生物代谢物可能已经错过了发现绝大多数微生物自然产品的机会[2-3]。在大多数环境中，不能被培养的微生物比能进行培养的微生物至少要多2～3个数量级[2-5]。同时纯培养技术也容易得到重复的菌种，传统的筛选方法得到相同代谢产物的几率很高。宏基因组技术可以有效地解决上述问题，Handelman于1998年首次提出宏基因组的概念，可以通过提取环境样品中的DNA，选择合适的载体和宿主，将DNA转化克隆到宿主细菌建立宏基因组文库，进而对文库进行筛选。此方法不需要经过纯培养方法同样可以对微生物的多样性及功能进行研究，扩大了微生物代谢产物及生物活性物质的筛选平台。近年来，研究者已构建了各种环境样品的宏基因组文库，并从中筛选到多种生物活性物质。Brady等[6]构建了凤梨科植物树茎流出液宏基因组文库，通过异源表达，获得具有抗菌活性的化合物palmitoylputrescine。Lim等[7]构建了森林土壤宏基因组文库，通过抗枯草杆菌（Bacillus subtilis）活性筛选，获得了indirubin and indigo。Kim等[8]构建了稻田土壤宏基因组文库，基于功能筛选，获得了coproporphyrin III。
DNA的提取方法主要有直接（原位）裂解法和间接（异位）裂解法2种，间接（异位）裂解法虽然能获得大片段的DNA（20～500 kb），纯度高，杂质少，但操作繁琐，成本高，得率低，且用此法获得的DNA全面性差，不适用于构建宏基因组文库。而直接（原位）裂解法是直接对环境样品中的微生物细胞进行DNA提取，提出的DNA片段较小（1～50 kb），此法操作简单、成本低、得率高，且DNA更具有代表性，比较适宜构建宏基因组文库，但用此法容易残留样品中的腐殖酸、棕黄酸等杂质。
笔者通过改良的土壤微生物总DNA提取方法，提取到片段较大的DNA分子，并用透析的方法对提取的DNA进行纯化，对最终的DNA用Nanodrop 2000进行含量和纯度的检测，得到的DNA的含量和纯度都达到文库构建的要求，为宏基因组文库的构建及后续利用文库筛选活性物质奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 土壤样品。供试土壤样品采集于不同地区，共2种土壤样品。采样时间是2014年6月，采集深度为10 cm，采集后马上密封于塑料封口袋中，于-20 ℃下保存待用。
1.1.2 主要仪器及试剂。
PCR扩增仪（Eppendof）;DYY6C电泳仪（北京六一仪器厂）;凝胶成像系统（美国UVP）;Nanodrop 2000（Thermo Scientific）高速冷冻离心机（Eppendof）。
裂解缓冲液（100 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L Na EDTA;1.5 mol/L NaCl，1%（W/V）cetyl trimethyl ammonium bromide）;10%SDS（pH8.0）;异丙醇;70%乙醇;TE（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8）。 1.2 试验方法
1.2.1 改良土壤微生物总DNA提取法。
1.2.1.1 土壤DNA的提取。
樣品过筛去除杂质，称取125 g土样加入150 ml裂解液，37 ℃、125 r/min离心约30 min。加入30 ml 10%SDS，70 ℃水浴2 h，每6～7 min缓慢摇匀。待样品冷却后4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液，量体积后加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀室温放置30 min后4 ℃、10 000 r/min离心30 min。弃上清液（完全去除液体），加入100 ml 70%乙醇，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃上清液，自然晾干，使样品完全没有乙醇味（可能需要放置过夜）。用5 ml TE重悬浮DNA（必要时可适当多加TE），轻轻翻动离心瓶，使DNA完全溶解，可在50 ℃下加热20～30 min，以加快溶解。
1.2.1.2 土壤DNA的纯化及浓缩。
制一块1%的琼脂糖凝胶，胶孔需能容纳1.0～1.5 ml DNA粗体液，将粗提液预热至50 ℃后，全部加入胶孔中，135 V电压下1 h后，将电压降至60 V 4～5 h，用0.5×TBE buffer清洗胶孔后，换掉胶槽中原有的TBE。将电压降至35 V过夜（约10 h），将胶两边各切下2.5 cm宽（其中1 cm宽含DNA），用EB染色30 min，在紫外灯下确定DNA条带位置，在原大胶上相应位置切下1 cm宽，包含DNA的胶条。将胶条放入透析袋中，加入10 ml的0.5×TBE，排除气泡，100 V下3 h，再30～40 V反向1 min。将透析袋中的TBE转移到50 ml离心管中，再用5 ml的TBE洗一遍透析袋后，转移到同一离心管中，5 400 r/min下离心20 min。将上清液转移到50 ml离心浓缩管中，5 400 r/min下离心10 min，多次离心使最后体积降至1 ml以下。在样品中加入15 ml TE，5 400 r/min下离心10 min，多次离心使体积降至250～500 μl，重复此步骤2～3次。用切口枪头轻柔地冲洗浓缩管膜几次，转移浓缩DNA至灭菌1.5 ml离心管中，再用500 μl TE冲洗浓缩管膜后，转移到另一1.5 ml离心管中。
1.2.2 PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法。
参照试剂盒相关说明书进行提取。
1.3 土壤DNA的含量及纯度检测
采用Thermo Scientific公司的Spectrophotometer Nanodrop 2000测定DNA含量，并测定A260/A280、A260/A230的比值以确定提取DNA的纯度。
2 结果与分析
2.1 土壤总DNA电泳结果
为了更好地为后续宏基因组文库的构建服务，土壤总DNA的大小应在23 kb以上。从图1可以看出，2个样品、2种提取方法的DNA大小都在23 kb以上，符合建库要求，但改良法提取的DNA条带明显比试剂盒的条带亮，说明提取的DNA含量较高;2种方法提取的DNA条带都较均匀且均无明显杂带，说明2种方法提取到的DNA相对较纯，且无明显杂质。
注：1、3为改良法提取的DNA，2、4为试剂盒法提取的DNA。M=λHind Ⅲ。
图1 2种方法所获得的土壤总DNA的凝胶电泳分析
2.2 土壤总DNA的得率和纯度
从表1可以看出，改良提取法的DNA获得率较高，提取的DNA浓度均在70 μg以上/g土壤，而用试剂盒法提取的DNA浓度在40 μg左右/g土壤。
表1 2种方法提取2种土壤样品的DNA得率
μg/g
土壤样品DNA含量
改良法试剂盒法
175.65±0.5436.37±0.45
273.12±0.3533.17±0.19
平均74.38534.77
在土壤样品提取过程中，一些杂蛋白、腐殖酸和酚类等物质往往会残留在DNA中而影响后期的文库构建等。通常检测DNA样品纯度的指标有A260/A280和A260/A230，前者主要用来检测蛋白质和酚类物质的残留情况，比值在1.8～2.0较理想;后者用来检测糖类、盐类等有机物残留情 况，比值在2.0～2.5较理想。从表2可以看出，2种提取方法提取的DNA纯度都较高，A260/A280都达到了1.6以上，而A260/A230也达到了1.7以上，比较接近理想水平。
表2 2种方法提取2种土壤样品的DNA纯度分析
方法A260/A280样品1样品2A260/A230样品1样品2
改良法1.64±0.171.61±0.071.75±0.121.73±0.11
试剂盒法1.68±0.091.66±0.051.81±0.041.78±0.06
3 结论
在基因组文库构建过程中，土壤DNA的片段大小以及DNA的纯度，都直接影响文库的质量，并影响后续文库的筛选。该研究采用改进的土壤总DNA提取法，提取的土壤DNA得率高，且相同重量的土壤，提取到的DNA量大，从而在一定程度上减少了非优势菌种的损失;同时改良法获得的DNA在片段大小以及纯度上也基本达到了理想水平。且采用改良法提取土壤DNA在同等条件下所需的费用比试剂盒法低很多，能节约大量的研究经费。综合各方面因素，该研究所使用的改良法是一种经济、高效的提取土壤总DNA的方法，提取的DNA能很好地用于构建高质量的宏基因组文库。 參考文献
[1] NEWMAN D J，CRAGG G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J].J Nat Prod，2007，70：461-477.
[2] HUGENHOLTZ P，GOEBEL B M，PACE N R.Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J].J Bacteriol，1998，180：4765-4774.
[3] RAPPE M S，GIOVANNONI S J.The uncultured microbial majority[J].Annu Rev Microbiol，2003，57：369-394.
[4] TORSVIK V，GOKSOYR J，DAAE F L.High diversity in DNA of soil bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1990，56：782-787.
[5] TORSVIK V，DAAE F L，SANDAA R A，et al.Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments[J].J Biotechnol，1998，64：53-62.
[6] BRADY S F，CLARDY J.Palmitoylputrescine，an antibiotic isolated from the heterologous expression of DNA extracted from bromeliad tank water[J].J Nat Prod，2004，67（8）：1283-1286.
[7] LIM H K，CHUNG E J，KIM J C，et al.Characterization of a forest soil metagenome clone that confers indirubin and indigo production on Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（12）：7768-7777.
[8] KIM J S，LIM H K，LEE M H，et al.Production of porphyrin intermediates in Escherichia coli carrying soil metagenomic genes[J].FEMS Microbiol Lett，2009，295（1）：42-49.
采用改良的方法提取2种土壤微生物总DNA，并采用透析法对提取的DNA进行纯化，与MO BIO公司PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法进行比较，结果表明，改良的土壤微生物总DNA提取方法提取到的DNA明显高于试剂盒提取的DNA，且A260/A280及A260/A230与试剂盒提取的相差不大，片段也较大，是一种经济方便的土壤微生物总DNA提取方法，比较适合用于构建高质量的宏基因组文库。
关键词 土壤微生物;透析法;DNA含量;宏基因组文库
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）34-12041-02
A Suitable Total Microbial DNA Extraction Method for Building Genomic Library
GAO Yue
（Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture， Suzhou， Jiangsu 215008）
Abstract Improved method was used to extract soil microbial total DNA， and the dialysis method was adopted to purify DNA. Compared with PowerSoil DNA isolation Kit of MO BIO company， the obtained DNA was analyzed. DNA per gram of soil is obviously higher than that of kit method. A260 / A280 and A260 / A230 also achieves the ideal level， the segment is larger and less impurities， indicating that it is an economic and convenient soil microbes total DNA extraction method， and is more suitable for building high quality metagenomic library.
Key words Soil microbes; Dialysis method; DNA content; Metagenomic library
微生物次級代谢产物已经被证明是开发新抗菌药物的重要来源[1]。对环境样品中未培养微生物的分析表明，在实验室中采用传统的培养微生物方法来筛选微生物代谢物可能已经错过了发现绝大多数微生物自然产品的机会[2-3]。在大多数环境中，不能被培养的微生物比能进行培养的微生物至少要多2～3个数量级[2-5]。同时纯培养技术也容易得到重复的菌种，传统的筛选方法得到相同代谢产物的几率很高。宏基因组技术可以有效地解决上述问题，Handelman于1998年首次提出宏基因组的概念，可以通过提取环境样品中的DNA，选择合适的载体和宿主，将DNA转化克隆到宿主细菌建立宏基因组文库，进而对文库进行筛选。此方法不需要经过纯培养方法同样可以对微生物的多样性及功能进行研究，扩大了微生物代谢产物及生物活性物质的筛选平台。近年来，研究者已构建了各种环境样品的宏基因组文库，并从中筛选到多种生物活性物质。Brady等[6]构建了凤梨科植物树茎流出液宏基因组文库，通过异源表达，获得具有抗菌活性的化合物palmitoylputrescine。Lim等[7]构建了森林土壤宏基因组文库，通过抗枯草杆菌（Bacillus subtilis）活性筛选，获得了indirubin and indigo。Kim等[8]构建了稻田土壤宏基因组文库，基于功能筛选，获得了coproporphyrin III。
DNA的提取方法主要有直接（原位）裂解法和间接（异位）裂解法2种，间接（异位）裂解法虽然能获得大片段的DNA（20～500 kb），纯度高，杂质少，但操作繁琐，成本高，得率低，且用此法获得的DNA全面性差，不适用于构建宏基因组文库。而直接（原位）裂解法是直接对环境样品中的微生物细胞进行DNA提取，提出的DNA片段较小（1～50 kb），此法操作简单、成本低、得率高，且DNA更具有代表性，比较适宜构建宏基因组文库，但用此法容易残留样品中的腐殖酸、棕黄酸等杂质。
笔者通过改良的土壤微生物总DNA提取方法，提取到片段较大的DNA分子，并用透析的方法对提取的DNA进行纯化，对最终的DNA用Nanodrop 2000进行含量和纯度的检测，得到的DNA的含量和纯度都达到文库构建的要求，为宏基因组文库的构建及后续利用文库筛选活性物质奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 土壤样品。供试土壤样品采集于不同地区，共2种土壤样品。采样时间是2014年6月，采集深度为10 cm，采集后马上密封于塑料封口袋中，于-20 ℃下保存待用。
1.1.2 主要仪器及试剂。
PCR扩增仪（Eppendof）;DYY6C电泳仪（北京六一仪器厂）;凝胶成像系统（美国UVP）;Nanodrop 2000（Thermo Scientific）高速冷冻离心机（Eppendof）。
裂解缓冲液（100 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L Na EDTA;1.5 mol/L NaCl，1%（W/V）cetyl trimethyl ammonium bromide）;10%SDS（pH8.0）;异丙醇;70%乙醇;TE（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8）。 1.2 试验方法
1.2.1 改良土壤微生物总DNA提取法。
1.2.1.1 土壤DNA的提取。
樣品过筛去除杂质，称取125 g土样加入150 ml裂解液，37 ℃、125 r/min离心约30 min。加入30 ml 10%SDS，70 ℃水浴2 h，每6～7 min缓慢摇匀。待样品冷却后4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液，量体积后加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀室温放置30 min后4 ℃、10 000 r/min离心30 min。弃上清液（完全去除液体），加入100 ml 70%乙醇，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃上清液，自然晾干，使样品完全没有乙醇味（可能需要放置过夜）。用5 ml TE重悬浮DNA（必要时可适当多加TE），轻轻翻动离心瓶，使DNA完全溶解，可在50 ℃下加热20～30 min，以加快溶解。
1.2.1.2 土壤DNA的纯化及浓缩。
制一块1%的琼脂糖凝胶，胶孔需能容纳1.0～1.5 ml DNA粗体液，将粗提液预热至50 ℃后，全部加入胶孔中，135 V电压下1 h后，将电压降至60 V 4～5 h，用0.5×TBE buffer清洗胶孔后，换掉胶槽中原有的TBE。将电压降至35 V过夜（约10 h），将胶两边各切下2.5 cm宽（其中1 cm宽含DNA），用EB染色30 min，在紫外灯下确定DNA条带位置，在原大胶上相应位置切下1 cm宽，包含DNA的胶条。将胶条放入透析袋中，加入10 ml的0.5×TBE，排除气泡，100 V下3 h，再30～40 V反向1 min。将透析袋中的TBE转移到50 ml离心管中，再用5 ml的TBE洗一遍透析袋后，转移到同一离心管中，5 400 r/min下离心20 min。将上清液转移到50 ml离心浓缩管中，5 400 r/min下离心10 min，多次离心使最后体积降至1 ml以下。在样品中加入15 ml TE，5 400 r/min下离心10 min，多次离心使体积降至250～500 μl，重复此步骤2～3次。用切口枪头轻柔地冲洗浓缩管膜几次，转移浓缩DNA至灭菌1.5 ml离心管中，再用500 μl TE冲洗浓缩管膜后，转移到另一1.5 ml离心管中。
1.2.2 PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法。
参照试剂盒相关说明书进行提取。
1.3 土壤DNA的含量及纯度检测
采用Thermo Scientific公司的Spectrophotometer Nanodrop 2000测定DNA含量，并测定A260/A280、A260/A230的比值以确定提取DNA的纯度。
2 结果与分析
2.1 土壤总DNA电泳结果
为了更好地为后续宏基因组文库的构建服务，土壤总DNA的大小应在23 kb以上。从图1可以看出，2个样品、2种提取方法的DNA大小都在23 kb以上，符合建库要求，但改良法提取的DNA条带明显比试剂盒的条带亮，说明提取的DNA含量较高;2种方法提取的DNA条带都较均匀且均无明显杂带，说明2种方法提取到的DNA相对较纯，且无明显杂质。
注：1、3为改良法提取的DNA，2、4为试剂盒法提取的DNA。M=λHind Ⅲ。
图1 2种方法所获得的土壤总DNA的凝胶电泳分析
2.2 土壤总DNA的得率和纯度
从表1可以看出，改良提取法的DNA获得率较高，提取的DNA浓度均在70 μg以上/g土壤，而用试剂盒法提取的DNA浓度在40 μg左右/g土壤。
表1 2种方法提取2种土壤样品的DNA得率
μg/g
土壤样品DNA含量
改良法试剂盒法
175.65±0.5436.37±0.45
273.12±0.3533.17±0.19
平均74.38534.77
在土壤样品提取过程中，一些杂蛋白、腐殖酸和酚类等物质往往会残留在DNA中而影响后期的文库构建等。通常检测DNA样品纯度的指标有A260/A280和A260/A230，前者主要用来检测蛋白质和酚类物质的残留情况，比值在1.8～2.0较理想;后者用来检测糖类、盐类等有机物残留情 况，比值在2.0～2.5较理想。从表2可以看出，2种提取方法提取的DNA纯度都较高，A260/A280都达到了1.6以上，而A260/A230也达到了1.7以上，比较接近理想水平。
表2 2种方法提取2种土壤样品的DNA纯度分析
方法A260/A280样品1样品2A260/A230样品1样品2
改良法1.64±0.171.61±0.071.75±0.121.73±0.11
试剂盒法1.68±0.091.66±0.051.81±0.041.78±0.06
3 结论
在基因组文库构建过程中，土壤DNA的片段大小以及DNA的纯度，都直接影响文库的质量，并影响后续文库的筛选。该研究采用改进的土壤总DNA提取法，提取的土壤DNA得率高，且相同重量的土壤，提取到的DNA量大，从而在一定程度上减少了非优势菌种的损失;同时改良法获得的DNA在片段大小以及纯度上也基本达到了理想水平。且采用改良法提取土壤DNA在同等条件下所需的费用比试剂盒法低很多，能节约大量的研究经费。综合各方面因素，该研究所使用的改良法是一种经济、高效的提取土壤总DNA的方法，提取的DNA能很好地用于构建高质量的宏基因组文库。 參考文献
[1] NEWMAN D J，CRAGG G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J].J Nat Prod，2007，70：461-477.
[2] HUGENHOLTZ P，GOEBEL B M，PACE N R.Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J].J Bacteriol，1998，180：4765-4774.
[3] RAPPE M S，GIOVANNONI S J.The uncultured microbial majority[J].Annu Rev Microbiol，2003，57：369-394.
[4] TORSVIK V，GOKSOYR J，DAAE F L.High diversity in DNA of soil bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1990，56：782-787.
[5] TORSVIK V，DAAE F L，SANDAA R A，et al.Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments[J].J Biotechnol，1998，64：53-62.
[6] BRADY S F，CLARDY J.Palmitoylputrescine，an antibiotic isolated from the heterologous expression of DNA extracted from bromeliad tank water[J].J Nat Prod，2004，67（8）：1283-1286.
[7] LIM H K，CHUNG E J，KIM J C，et al.Characterization of a forest soil metagenome clone that confers indirubin and indigo production on Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（12）：7768-7777.
[8] KIM J S，LIM H K，LEE M H，et al.Production of porphyrin intermediates in Escherichia coli carrying soil metagenomic genes[J].FEMS Microbiol Lett，2009，295（1）：42-49.